[发明专利]一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法。本发明利用诱导性多能干细胞(iPS细胞)作为供体细胞，通过对RTL1进行剂量补偿表达之后，显著提高了克隆胚胎的妊娠率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法。

背景技术

自从第一头克隆哺乳动物克隆羊“多利”诞生以来，核移植(NT)克隆技术已成功地应用于20多种哺乳动物中，但是哺乳动物克隆的效率(定义为出生/重构卵母细胞的存活率)依然处于很低水平，例如，克隆小鼠的效率为1-2％(Ogura et al.,2013)，克隆猴子的效率为1.5％(Liu et al.,2018)，克隆猪的效率为0.3％，克隆绵羊的效率为0.3％，克隆马的效率为0.8％，克隆奶牛的效率为1.7％等(Keefer et al.,2015)。换言之，也就是大约99％的体细胞核移植克隆胚胎并没有发育至成熟个体，在妊娠期的各个阶段出现了大规模的流产现象(Keefer，2015)。表观遗传重编程是核移植重编程过程中重要的一环，而表观的异常修饰往往会造成核移植实验的失败，但是其具体机制并不清晰。

猪由于在遗传学、解剖学和生理学等各个方面相较于传统的模式动物小鼠更加接近于人类，现在已经越来越多地被用作研究人类疾病和器官移植的模型(Niu et al.，2017；Yan et al.，2018)。由于至今并未有猪ES细胞建系成功的报道，因此，科研工作者经常采用体细胞核移植克隆的方法来获得所需要的模型。之前的研究表明，当猪iPS细胞(诱导性多能干细胞)作为供体细胞时，约99.99％的核移植克隆胚胎将会出现发育阻滞现象，这比体细胞核移植克隆胚的发育效率低了将近100倍(Du et al.，2015；Fan et al.，2013；Yuan et al.，2014)。这些猪iPS细胞核移植克隆胚在体外发育至囊胚的效率约为10％-30％，和体细胞核移植克隆胚较为相似，但是在植入后将会发生大规模的流产现象，这也就为我们研究哺乳动物植入后胚胎发育提供了一个绝佳的机会。

反转录转座子1(Retrotransposon-like-1，RTL1)基因，又名父本表达基因11(Paternally expressed gene11，PEG11)，定位于人的14号染色体长臂(HSA14q32.2)，位于母本表达基因MEG3和MEG8之间，但RTL1基因是一个父本表达基因，包含一个无内含子的ORF(Open Reading Frame)，编码1358aa(Kagami et al.，2008)；在鼠上定位于12号染色体远端，没有内含子，编码1745aa，也表现为父本表达(Sekita et al.，2008)；在绵羊中的印记状态与上述两个物种相同(Charlier et al.，2001)。之前有研究表明，RTL1在毛细血管内皮细胞的形成中起到重要的作用，而毛细血管内皮细胞对于维持母胎的界面和胎盘的发育都是不可或缺的(Sekita et al.,2008)。在小鼠体内受精胚胎中不表达RTL1基因会导致小鼠胎盘发育异常，从而使胎儿发育阻滞在妊娠晚期15.5天。人的RTL1基因发生突变，会导致面部表情异常或者喇叭状胸，基因功能丧失，会导致生长停滞(Kotzot2004；Kagami etal.，2005)。RTL1基因位于DLK1-DIO3印记区域，此区域基因对肌肉密度和脂肪沉积有一定的影响(Kim et al.，2004；Li et al.，2008)。另外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍(Bidwell et al.，2004；Fleming et al.，2009)。

然而，未见调控供体细胞中RTL1基因以提高克隆胚胎哺乳动物受体的妊娠率的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供涉及一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法，旨在提高以诱导性多能干细胞作为供体细胞，克隆胚胎哺乳动物受体的妊娠率。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：