[发明专利]一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法

说明书

本发明公开了一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，所述的方法包括如下步骤：无血清的间充质干细胞的上清液的收集：首先进行间充质干细胞的培养，更换培养基培养，离心，去除细胞碎片，得到初始上清液；取所述初始上清液在进一步梯度离心，将所述离心后的上清液转移到无菌离心管中，离心，收集到含有微囊泡的上清液；将含有微囊泡的上清液离心，得到含有外泌体的沉淀，清洗，然后再离心，得到外泌体沉淀；将得到的外泌体沉淀，加入无菌PBS，过滤，得到所述的特异性的间充质干细胞外泌体。本发明收集的外泌体采用过滤膜过滤，可以确保提取的外泌体为纳米级；同时降低并优化了转速，减少了高速的机械损伤，分离效率高，成本低。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchyaml stem cells,MSCs)是一类多能干细胞，它源于发育早期的中胚层和外胚层，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种组织中分离，经诱导后可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经肝、心肌和内皮等多种组织细胞。过去，常常认为间充质干细胞可巢居到受损部位后直接定向分化为靶细胞来发挥作用。然而，有研究表明，间充质干细胞巢居到损伤部位的比例和分化为靶细胞的数量都是非常有限的，而且分化为所需靶细胞的这一过程非常短暂，与观察到的治疗效果在时间上互相矛盾。因此，越来越多的研究倾向于认为间充质干细胞主要通过旁分泌机制来分泌多种细胞因子作用于其他细胞来发挥作用。

外泌体(Exosome,Exo)作为旁分泌的一个重要组成部分，它是由各种活体细胞分泌的大小约为30～100nm之间，密度在1.13～1.19g/ml之间的脂质双层膜囊泡状结构小体，与质膜融合后，以胞吐形式释放到细胞外环境中。当外泌体与靶细胞接触后，外泌体及其携带的生物分子(如功能性的脂类、蛋白质，信使RNAs(mRNAs)、microRNAs等分子)以胞吞的形式被接收并发挥作用。因此，大量的研究也发现间充质干细胞确实可以通过自身的外泌体发挥与细胞相类似的组织修复、免疫抑制调节免疫功能等作用。如早在2007年，Timmer等团结就发现，MSC的细胞外基质可以有效地减轻缺血再灌注损伤，通过猪的心脏缺血/再灌注模型给予MSC的细胞外基时质处理，可以减少心脏梗死面积达将近60％。通过对细胞外基质内在活性物质的研究分析，电镜观察到是一群大小在50～200nm间的脂质双分子囊泡，并且特异性表达CD81、CD9、ALIX等蛋白，基本符合外泌体的基本特性。除此之外，在肾损伤修复方面，有人通过5/6肾全切构建小鼠慢性肾损伤模型时，分别给与30ug间充质干细胞外泌体和1×10⁶间充质干细胞，通过尾静脉注射处理，7天后解剖显示,与给予PBS的空白对照组相比，间充质干细胞处理组和间充质干细胞外泌体处理组的小鼠血尿素氮、血肌酐、尿酸比例都出现减少，改善了组织纤维化和间质淋巴细胞浸润现象。这些均证实，间充质干细胞确实可通过分泌外泌体发挥旁分泌功能。并且与细胞治疗相比较，外泌体性质更稳定，保存运输方便，没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险，因此这种“无细胞的外泌体”有望成为一种新的治疗策略。如何获得分离外泌体并获得高纯度的外泌体是当前科研工作者及其关注的问题，它对后续的应用研究至关重要。因此，本专利针对此问题发明一种可收集高浓度的、特异性的间充质干细胞来源的外泌体。

目前，外泌体的分离提取方法主要有：超速离心、免疫磁珠、超滤法、沉淀或试剂盒等方法。这些方法具体如下：

1、超速离心法(差速离心法)：超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行:即细胞培养上清液在300g，10min离心，沉淀，取细胞上清液；2000g离心10min去除死细胞沉淀，取上清液；再接着1000g，30min分离，沉淀，去除细胞碎片沉淀物，获得的上清在＞10000g，70min分离条件下，获得的沉淀为外泌体沉淀和其他干扰蛋白质，最后将这些沉淀再次用PBS洗涤，在＞100000g离心70min，沉淀即可得到外泌体。超速离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。