[发明专利]一种濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法

说明书

本发明提供一种濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法，属于植株再生研究领域。通过选取富民枳当年生嫩茎为外植体材料，经过消毒处理后，接种于腋芽启动培养中诱导腋芽萌发生长，待腋芽萌生枝长至2‑3cm时，切下后接种于增殖培养基中，得到增殖培养幼苗，将继代增殖培养的高度在3‑4cm无根幼苗单株切下，转接于生根培养基中诱导生根培养15‑20d，得到萌生不定根的完整组培苗。有效解决富民枳快速扩繁的问题，能更好地开展濒危物种富民枳的拯救，同时也为人工快速培育富民枳苗木进行回归种植，重建富民枳野外种群提供技术支撑，因此，对富民枳抢救性保护及野外种群重建具有重要意义。

技术领域

本发明属于植株再生研究领域，尤其涉及一种濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法。

背景技术

富民枳(Ponciruspolyandra)属于芸香科枳属，为我国原产，是丁素琴等于1984年在云南省富民县发现的一新种。其特征为常绿小乔木，成年树体高约2.5m，新梢呈三棱形，绿色，老枝圆整，叶腋着一芽一短尖刺。花期3～4月，果成熟期为10～11月，较普通枳果实大，黄色，扁圆球形，果面粗糙，基部浅洼，有放射沟纹。芸香科枳属只有两个种属于中国特有种，即枳和富民枳。枳原产于中国中部；富民枳仅分布于云南省富民县，是珍贵的柑橘育种种质资源。

富民枳分布区域狭小，仅分布于云南省富民县老青山周边，海拔下限2100米，海拔上限2400米，生于峡谷阳坡，石岩山地灌丛中，属于云南省特有的枳属树种，于1989年被列入《云南省第一批省级重点保护野生植物名录》。据相关文献资料记载，在上世纪八十年代，老青山东侧东瓜岭山谷中有大量的富民枳野生资源分布。但中国科学院昆明植物研究所于1992年开展富民枳野外资源调查时，在其原产地仅发现15株野生植株。随着生态环境不断恶化和修建道路等工程实施，富民枳野外资源急剧减少，于1999年列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》。2012年，昆明市濒危动植物收容拯救中心与富民县林业局联合开展富民枳野生资源调查，在其原产地仅发现1株野生植株。因此，除迁地保护的22株外，富民枳的野生资源已基本灭绝，开展其抢救性保护迫在眉睫。

在育苗繁殖技术方面，相关文献仅见杨曼和张敏，“6～BA、NAA植物激素对富民枳组织培养的影响”以培养基诱导愈伤组织，切取茎尖和带侧芽的茎段，运用不同浓度的6～BA和NAA对富民枳茎段进行分化培养形成愈伤组织，(林业调查规划[J],2007,32(6):149～151)。目前，富民枳的离体再生体系尚未建立，导致富民枳幼苗无法进行快速扩繁。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的问题，在此的目的在于提供一种能够有效解决富民枳快速扩繁的问题的濒危物种富民枳离体再生体系的建立方法。该方法包括以下步骤：

步骤1：外植体选取与消毒：选取富民枳嫩芽并进行冲洗后剪成含有叶腋的茎段，对茎段进行消毒；

步骤2：腋芽启动培养：将步骤1中的茎段斜插于腋芽启动培养基上进行培养，得到萌生腋芽；

步骤3：增殖培养：将经步骤2得到的腋芽插于增殖培养基上，腋芽基部形成大量丛生芽，将丛生芽进行切割分离，接种于相同增殖培养基培养，得到增殖培养幼苗；

步骤4：生根培养：将步骤3得到的增值培养幼苗切下，接种于生根培养基上进行培养，得到富民枳生根苗。

进一步的，所述步骤1的具体步骤是：选取富民枳树体春季萌生嫩茎，去除叶片；去除表面杂质，加洁尔灭用净水冲洗0.5h以上，剪成2～3cm长含1～2个叶腋的茎段，置于超净工作台采用75％乙醇浸泡10～12s进行消毒，无菌蒸馏水冲洗2次，移入0.1％升汞浸泡处理10min，无菌水冲洗3～5次，用消毒滤纸吸干外植体表面残留水分后进行接种。