[发明专利]猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，属于医药技术领域。本发明所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒BJ株，命名为BJ，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15911。实验证明，使用本发明制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗免疫初产健康猪用于预防猪伪狂犬病，具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。并且能够与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，在猪伪狂犬病防治领域将具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的高死亡率的急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpes viridae)、猪疱疹病毒属。伪狂犬病毒能感染多种宿主，但猪是该病毒的主要天然宿主、贮存者和传播者。猪伪狂犬病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。

PRV为α疱疹病毒科、水痘病毒属成员，其基因组为线性双股DNA，由独特的长区段(UL区)、独特的短区段(US区)、内部重复序列(IR)和末端倒转重复序列(TR)构成。PRV基因组约含70～100个编码蛋白质基因，其中gE、gI、gC、TK、PK等基因与PRV毒力相关且为PRV增殖非必需基因。gE、gI与PRV嗜神经性和在神经系统中传播有关，通过形成的异源二聚体发挥作用。

我国猪场自20世纪末开始使用伪狂犬基因缺失疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬的临床症状并产生严重的经济损失。有关研究学者对多个省份免疫猪场的临床样品进行了PRV野毒的分离鉴定、gE基因序列分析及血清中和试验，结果初步表明新分离PRV流行毒株较以往毒株发生明显变异，对小鼠、猪的致病性明显增强；发病仔猪出现瘙痒症状，嗜内脏组织性增强。因此，研制针对此次再发流行毒株的疫苗，十分必要。

目前，免疫接种是PR防控的主要措施。目前，我国应用较多的是Bartha K61弱毒疫苗株，同时可应用gE抗体ELISA方法和基于PRV gE基因建立的荧光定量PCR等PCR方法来区分感染动物和免疫动的区分。根据检测和监测结果，逐渐实现从猪群中清除PRV野毒感染动物并逐步实现PRV的净化。因此，一方面研制针对PRV变异毒株的候选疫苗株；另一方面，候选疫苗株的应用要与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，所以以PRV变异毒株为亲本构建基因缺失病毒是必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够配合PRV净化的DIVA战略的用于防治国内流行PRV变异毒株的PRV疫苗株及其用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人用ST细胞从河北、东北、北京等地的猪场送检的疑似猪伪狂犬病发病猪病料中分离获得6株伪狂犬病毒，对6株PRV病毒进行PCR鉴定和gB、gE基因序列测定分析，结果发现6株病毒均与近几年分离的变异株病毒亲缘关系较近，为变异株猪伪狂犬病毒。动物回归试验显示，6株病毒均可引起小鼠、家兔发病或死亡。经仔猪接种试验，分离的BJ株毒力最强。通过后期的试验结果表明其免疫原性良好，可作为疫苗研究的候选毒株。