[发明专利]复合酶制剂的生产和纯化工艺

权利要求书

1.复合酶制剂的生产和纯化方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备里氏木霉种子液，将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到里氏木霉种子液；

步骤2）制备匍枝根霉种子液，将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得匍枝根霉种子液，所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比；

步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到短小芽孢杆菌种子液；

步骤4）制备产酶培养基，包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3-4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基；

步骤5）混合发酵产酶，包括如下步骤：往发酵罐中装60% v/v的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照5-10%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为 1:1.5，搅拌转速为 100rpm，培养温度为 30-32℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为5-10%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度30-32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉20-40g/L，继续培养48-60h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为7.5-8.5；

步骤6）分离和纯化，包括如下步骤：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合，并置于0℃冰水浴处理60min，然后8000rpm离心分离10-15min，收集下层沉淀，再添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂；

所述里氏木霉为里氏木霉ATCC66589，所述匍枝根霉为匍枝根霉ATCC60748，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌ATCC700814。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得。