[发明专利]对硒代半胱氨酸进行修饰的方法及其应用

说明书

本发明提出了一种对硒代半胱氨酸进行修饰的方法及其应用。该方法包括：在pH为3.5～5.5的条件下，使硒代半胱氨酸与烷基化试剂反应，以便获得烷基化硒代半胱氨酸。发明人发现，在pH为3.5～5.5的条件下，烷基化试剂能特异性地与硒代半胱氨酸发生反应，而不与或者极少与半胱氨酸反应，且收率高、操作简单，同时利用烷基化试剂上携带的标记基团(如生物素)等，可以在硒代半胱氨酸上引入标记基团，进而通过合适的手段(如利用亲和素与生物素特异性结合)将含有硒代半胱氨酸的多肽或蛋白质富集出来，该方法基本可以对所有已知硒蛋白进行鉴定和定量。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地，本发明涉及对硒代半胱氨酸进行修饰的方法及其应用，更具体地，本申请涉及针对硒代半胱氨酸位点进行硒蛋白富集的方法及其应用。

背景技术

硒是人体健康中重要的微量元素。硒缺乏与许多人类疾病的发病有关，包括糖尿病，癌症和神经退行性疾病。在生物体内，硒的生物学效应主要由硒蛋白介导，这些蛋白质含有一个或多个硒代半胱氨酸(Sec，U)位点。被认为是第21种氨基酸的硒代半胱氨酸是半胱氨酸(Cys，C)类似物，其中含硒的硒醇基取代了Cys中的含硫巯基。硒蛋白存在于很多生物种类中，其中在人类中发现25种硒蛋白，小鼠中发现24种，大肠杆菌中发现3种。

许多特征性硒蛋白已被证明可以作为抗氧化剂或氧化还原酶来调节细胞的氧化还原循环。硒蛋白是高度有效的细胞内氧化还原状态的调节剂，因为它们可以催化形成二硫键并且以高于它们的硫类似物四个数量级的速度将二硫键还原。硒蛋白的失调与氧化还原相关的人类疾病有关，如心血管疾病，癌症，阿尔茨海默氏病和帕金森氏病等。

开发硒代蛋白质组的高效分析方法面临的主要挑战包括硒醇基团的高反应性及其与半胱氨酸(Cys)基团的相似性，这使得难以选择性地针对硒代半胱氨酸进行反应，并对低丰度的硒蛋白进行富集。

因而，开发能选择性地富集硒蛋白的方法迫在眉睫。

发明内容

目前现有技术中还没有能高选择性富集含有硒代半胱氨酸的多肽和蛋白质的方法。发明人首次开发了含Sec的多肽和蛋白质的富集方法，该方法通过在较低的pH条件下，在合适的烷化剂的条件下，选择性地富集含Sec的肽和蛋白质。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种对硒代半胱氨酸进行修饰的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在pH为3.5～5.5的条件下，使硒代半胱氨酸与烷基化试剂反应，以便获得烷基化硒代半胱氨酸。发明人发现，Sec的pKa值比Cys低，在低pH的条件下Sec与Cys相比，更不容易质子化，从而在低pH(如3.5～5.5)的条件下Sec更容易与烷基化试剂反应，进而发明人发现，在pH为3.5～5.5的条件下，烷基化试剂能特异性地与硒代半胱氨酸发生反应，而不与或者极少与半胱氨酸反应，且收率高、操作简单。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述pH为4.0～5.5。由此，在pH为4.0～5.5的条件下，烷基化试剂能更特异性地与硒代半胱氨酸发生反应。

根据本发明的实施例，所述pH为4.0。发明人通过实验发现，在pH为4.0的条件下，硒代半胱氨酸烷基化反应的选择性进一步提高，其选择性比pH在8.0的条件下提高了5倍。由此，在pH为4.0的条件下，烷基化试剂能更特异性地与硒代半胱氨酸发生反应。

根据本发明的实施例，所述烷基化试剂携带标记基团。发明人发现，通过在烷基化试剂上引入标记基团，进而能在硒代半胱氨酸上引入标记基团，从而可以用合适的分离手段通过标记基团将含有硒代半胱氨酸的肽段富集出来。其中，在烷基化试剂上引入标记基团包括但不限于通过click反应或者其他化学反应引入标记基团。