[发明专利]一株广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌及其复合菌制剂

权利要求书

1.一株广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.15949，保藏日期为2018年6月19日。

2.一种权利要求1所述的广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌在抑制弧菌中的应用。

3.一种权利要求1所述的广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌在水产养殖中的应用。

4.根据权利要求3所述的广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌在水产养殖中的应用，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌全池泼洒或拌料投喂。

5.根据权利要求3所述的广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌在水产养殖中的应用，其特征在于，将该芽孢杆菌兑水直接泼洒，其用量为10⁸cfu/m³；或拌料投喂，其用量为10¹¹cfu/kg。

6.一种以权利要求1所述的广谱抑制水产病原性弧菌的芽孢杆菌为主要成分的复合菌制剂，其特征在于，所述复合菌制剂是由枯草芽孢杆菌BSXE-1601和蜡样芽孢杆菌BCXE-01以5～8:1的细菌数比例复合而成。

7.一种权利要求6所述的复合菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子液培养

分别取分离、纯化得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BSXE-1601和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE-01的保种液于营养琼脂和2216E固体培养基上进行划线，并分别置于37℃和28℃条件下，活化24h；然后分别挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE-01单菌落接种于改良后的营养琼脂培养基中，于28℃、190rpm条件下培养24h，得到两种细菌的种子液；

所述营养琼脂培养基的配方如下：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH为7.3，将配制好的培养基121℃，101KPa灭菌30min后使用；

所述2216E固体培养基的配方如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000mL，pH为7.6，将配制好的培养基121℃，101KPa灭菌30min后使用；

所述改良后的营养琼脂培养基配方如下：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸馏水1000ml，pH为7.3，将配制好的培养基121℃，101KPa灭菌30min后使用；

(2)扩大培养

两种菌的种子液按枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSXE-1601：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE-01＝5～8:1的细菌数量比例进行混合后，控制此时混合种子液的细菌含量为1×10⁶～1×10⁷cfu/ml，按照混合种子液：改良后的营养琼脂培养基的体积比为1:10的比例，将混合种子液接种到装有改良后的营养琼脂培养基的发酵罐中，于温度为28℃，搅拌速度为190rpm，通气量为4V/V.min，培养24h；

(3)复合菌剂的制备

按照混合种子液：液体发酵培养基的体积比为1:10的比例将混合种子液接种到装有液体发酵培养基的发酵罐中，控制此时混合种子液的细菌含量为1×10⁶～1×10⁷cfu/ml，于温度为28℃，搅拌速度为190rpm，通气量为4V/V.min，培养48h后，浓缩得高浓度菌液；所述液体发酵培养基的配方如下：蛋白胨10g，玉米浆10g，葡萄糖10g，氯化钠5g，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，将配制好的培养基121℃，101KPa灭菌30min后使用；

将花生粕、玉米粉、硅藻土、膨润土按照2:2:1:1的重量比例混合均匀并粉碎，制得辅料载体；将辅料载体和高浓度菌液按照1:2的重量比例混合均匀，再加入聚山梨酯和黄原胶，其中聚山梨酯的加入量为高浓度菌液质量的2-3％，黄原胶的加入量为高浓度菌液质量的1-3％；混合均匀，经烘干、粉碎、再混合均匀，即得复合菌制剂。