[发明专利]一种可双光子荧光检测硝基还原酶NTR探针及其制备方法

说明书

本发明涉及一种可双光子荧光检测硝基还原酶(Nitroreductase，NTR)探针的制备，如图(Ⅰ)，属于有机荧光探针领域。一种可双光子荧光检测硝基还原酶(NTR)探针的结构式如所示。本发明荧光探针能够精确检测细胞内的硝基还原酶(NTR)含量且避免细胞内的其他还原剂的干扰。另外，该探针具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现细胞水平硝基还原酶(NTR)含量的检测并指示细胞低氧情况，可进一步应用癌症前期检测的研究。

技术领域

本发明涉及一种可双光子荧光检测硝基还原酶NTR探针及其制备方法，属于有机荧光探针领域。

背景技术

硝基还原酶(NTR)作为肿瘤细胞的低氧标志物之一，是一类依赖于黄素单核苷酸或黄素腺嘌呤二核苷酸的细胞质酶,广泛存在于细菌中。结构中一般包含黄素单核苷酸单元或黄素腺嘌呤二核苷酸单元，它能够利用烟酰胺嘌吟二核苷酸(NADPH)烟酰胺嘌吟二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅酶，实现对多种硝基化合物的还原代谢，生成羟胺或氨基。肿瘤细胞缺氧通常也可导致胞内硝基还原酶增加。因此，在电子供体如NADH/NADPH的存在下,硝基还原酶可以将芳香族硝基化合物有效还原为相应的氨基化合物。这种还原行为可用来设计含硝基的荧光探针对实体瘤细胞的缺氧状况进行检测，直接指示肿瘤细胞的存在，具有十分重要的意义。

低氧，是肿瘤细胞的非常重要的特点之一，而硝基还原酶作为目前作为肿瘤细胞的最为重要的低氧标志物之一，促使它一直作为科学研究中的重中之重。在肿瘤细胞的低氧标志物的研究中，多以荧光探针主，一个理想的荧光探针必须具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。至今已经报道出来了很多肿瘤细胞的低氧标志物荧光探针，如检测硝基还原酶、心肌黄酶、醌还原酶、偶氮还原酶等生物小分子的荧光探针，但是这些荧光探针都存在一个较大的缺点就是探针水溶性普遍较差，且斯托克斯位移较小，在成像过程中激发光会造成不同程度的干扰，并且大部分探针的组织穿透能力不够好，造成研究结果说服力不足。为了解决这一存在已久的问题，急需研发一种具有较好的水溶性，较大的斯托克斯位移的双光子硝基还原酶的荧光探针。

发明内容

为了解决以上的问题，本发明提供一种可双光子荧光检测硝基还原酶NTR探针具有较好的水溶性、较大的斯托克斯位移的双光子硝基还原酶的荧光探针及其制备方法。

本发明采用的技术方案是一种可双光子荧光检测硝基还原酶NTR探针，其特征在于，所述的荧光探针为基于萘酚荧光团双光子荧光团的探针XD03，荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：

本发明采用的另一技术方案是：所述的荧光探针XD03的制备方法包括如下步骤：

将双光子萘酚衍生物XD02、丙二腈依次加入到乙醇溶液中，氮气保护，在0℃反应条件下搅拌3-5h，旋转蒸发除去有机溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用去离子水萃取两次，盐水萃取，收集有机相干燥，旋转蒸发除去溶剂，经过胶柱层析提纯得到中间产物XD03，上述的双光子萘酚衍生物XD02、丙二腈的摩尔比为1：1.0-6.0，反应式如下:

优选的，所述的XD02和丙二腈的摩尔比为1:1；所述的荧光探针XD03的制备方法中，干燥为用无水硫酸钠进行干燥；所述的荧光探针XD03的制备方法中，每mmol的XD02加入乙醇20-23mL；反应过程中，丙二腈的当量不能太多，否则会产生副产物，降低产率，其次反应一定要保持氮气保护且在低温环境环境,否则会导致产生其他的杂质。

优选的，所述的可双光子荧光检测硝基还原酶探针前体物质XD02的制备方法如下：