[发明专利]骨骼肌特异性启动子及应用

说明书

本申请属于基因工程应用和生物技术领域。本发明提供了一种改造的骨骼肌特异性启动子2eMCK‑pMCK‑T208，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将其与目的基因相连后，通过腹腔注射发现在心肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量比2eMCK‑pMCK低，表现为差异显著，而在骨骼肌中经2eMCK‑pMCK‑T208启动表达的目的蛋白表达量与2eMCK‑pMCK启动的相比，其差异不显著。本发明所公开的启动子能使外源基因在骨骼肌中高效特异性表达，不但可以提高猪肌肉品质，还可以降低因启动子特异性不高而带来的潜在危害。

技术领域

本研究涉及属于基因工程应用和生物技术领域，涉及骨骼肌特异性启动子和miR-208 及应用，该改造启动子降低了目的基因在心肌中的表达水平，从而提高启动子组织特异性。

背景技术

在基因编辑技术越来越成熟的现在，使外源基因能够在体内特异性表达已成为基因编辑技术应用的一个亟待解决的问题。而我们利用转基因技术改善猪肌肉品质也遇到了类似的问题。

目前对外源基因进行肌肉特异性调控的启动子有许多。肌肉特异性unc45b有助于肌节肌球蛋白的折叠。斑马鱼肌肉特异性基因unc45b最小启动子503unc可以驱动斑马鱼肌肉组织中的基因表达(Berger and Currie 2013)。在哺乳动物中，肌肉肌酸激酶(MCK)基因在从成肌细胞向肌细胞分化过程中被激活，并且已经充当肌肉发育的标志并且驱动转基因小鼠中的转基因表达。MCK启动子在幼年蝌蚪和成年蛙中的骨骼肌高效转基因表达(Lim,Neff et al.2004)。肌营养不良蛋白启动子可以使外源基因在小鼠的骨骼肌的中表达，其恢复肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(Anderson,De Repentigny et al.2006)。但是这些肌肉特异性启动子并不是骨骼肌特异性启动子，有些除了在骨骼肌中高效表达外，在心肌中也有较高的表达水平，例如MCK基因启动子。

miRNA是转录后调控元件，能够与mRNA 5’UTR区结合从而沉默或降解目的基因。大量的研究表明miRNA的表达具有组织特异性(Barad,Meiri et al.2004,Baskerville andBartel 2005)。MiR-208家族能调节心脏应激反应，是具有高度保守性以及心肌组织特异性的一类miRNA(van Rooij,Sutherland et al.2007,Montgomery,Hullinger et al.2011)，在心肌疾病的研究中起着重要作用。Wang等人的研究结果表明：90.9％AMI病人和100％症状发作4个小时内的AMI患者容易检测到miR-208a。这也说明，miR-208a可以作为早期A MI更敏感的标志物。心脏纤维化可导致心肌机械僵硬，从而导致其收缩功能出现障碍，而Satoh等人的数据表明miR208a是参与心脏纤维化和肥厚性生长的基因表达的基础。

目前所应用的肌肉特异性启动子并不仅仅只在骨骼肌中表达，其在心肌中也有较高水平的表达。而尽管miR-208在心肌疾病中的研究比较深入，但是关于miRNA在5’UTR区发挥作用并无相关报道。本发明利用miR-208心肌特异性和转录后水平调控的特点，将miR-208的种子序列与肌肉特异性启动子串联，以降低该启动子在心肌中的表达，从而提高启动子骨骼肌特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨骼肌特异性启动子，所述启动子命名为：2eMCK-pMCK- T208，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供SEQ ID NO.1所示的骨骼肌特异性启动子的应用，将该启动子与目的基相连，可启动目的基因在骨骼肌中的的特异性表达。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种骨骼肌特异性启动子2eMCK-pMCK-T208，所述启动子的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。