[发明专利]一种鸭瘟病毒的培养方法

说明书

本发明提供了一种鸭瘟病毒的培养方法，属于病毒培养技术领域。本发明以鸡胚成纤维细胞系DF‑1作为鸭瘟病毒宿主，采用逐步驯化的方式，通过超剂量接毒、细胞液中添加鸡胚尿囊液、逐代盲传的方式，使鸭瘟病毒适应DF‑1细胞系并产生细胞病变。本发明的鸭瘟病毒培养方法操作简单，DF‑1细胞系培养鸭瘟病毒生长良好，病毒含量达10^7.4~10^8.0 TCID₅₀/ml，较CEF细胞培养的病毒含量提高0.25‑0.75个滴度，避免了CEF细胞培养病毒存在外源病毒污染的安全隐患，并且由于DF‑1细胞建库后，对产品生产的稳定性和持续性提供了保证，随用随取，省时省力，工艺放大更简单易行，极大地降低了鸭瘟病毒培养过程中的生产成本，能够取得提高安全性和降低成本的双赢，经济效益显著。

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术领域，具体地涉及病毒培养技术领域，特别是涉及一种以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养鸭瘟病毒的方法。

背景技术

鸭瘟（Duck Plague，DP），是由鸭瘟病毒（Duck Plague Virus，DPV）引起的鸭、鹅及多种雁目禽类的一种急性败血性传染病。DPV传播迅速，流行广泛，发病率和死亡率非常高，给养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。鸭群接种鸭瘟病毒疫苗是防制鸭瘟的有效措施之一，生产鸭瘟病毒疫苗需要培养大量的鸭瘟病毒液。我国目前繁殖鸭瘟病毒所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞（CEF）。虽然国家已规定所使用的鸡胚必须来源于SPF鸡群，但是由于检测的滞后性及饲养环境的复杂性，使得生产鸭瘟用CEF细胞存在外源病毒污染的安全隐患；另外，生产时要用大量鸡胚，劳动强度大，同时也加大了CEF细胞被污染的可能性。目前已有报道表明鸡肝癌细胞系可作为鸭瘟病毒的宿主细胞，但是鸡肝癌细胞极不易培养，增加了鸭瘟病毒培养的生产成本，并且由于鸡肝癌细胞具有致癌性，不能用于活疫苗的生产。

DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ELL鸡胚胎，该细胞在形态上呈纤维状。DF-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已有研究表明传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒、新城疫病毒均能在DF-1细胞上生长良好，但常见的鸭瘟病毒株无法直接在DF-1细胞上生长并产生细胞病变，目前没有DF-1细胞系培养鸭瘟病毒方法的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种无外源病毒污染、操作简便、成本低、细胞原料易获得的鸭瘟病毒的培养方法。

本发明的另一目的在于提供DF-1细胞在生产鸭瘟病毒液中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种能够在DF-1细胞生长的鸭瘟病毒及其驯化方法。

本发明首先提供了一种鸭瘟病毒的培养方法，是采用鸡胚成纤维细胞系DF-1培养鸭瘟病毒。

具体地，本发明的鸭瘟病毒的培养方法包括以下步骤：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后5-10日收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；

（3）收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-10%的体积比接种于DF-1细胞，培养。

其中，步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

所述病毒液为CEF细胞培养的鸭瘟病毒液。

本发明的鸭瘟病毒的培养方法中，优选地，可设立空白对照组，处理方式为以CEF细胞液为接种源来接种DF-1细胞，若空白对照组整个培养过程均为阴性（每次盲传接种后5-10日均无CPE），则培养方法可信。