[发明专利]一种多糖测定分析方法及其应用

说明书

本发明提供一种多糖测定分析方法，包括以下步骤：(1)多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；(2)衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；(3)测定分析，采用UPLC‑MS或/和UPLC‑FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息。本发明提供的多糖的测定方法可以克服现有技术中对水解得到的特征寡糖片段分离度差、易受共流出组分影响等不足。

技术领域

本发明涉及糖类测定技术领域，尤其涉及一种多糖测定分析方法及其在菌类中的应用。

背景技术

多糖是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。1969年，日本的千原从香菇中分离出抗肿瘤活性的多糖掀起了一股从食用菌中寻找抗肿瘤成分的高潮。实际上，真菌多糖因其显著的生物活性如免疫调节、降血糖、抗氧化和抗炎抗病毒等确已引起了人们广泛的关注[陈忠杰，等.广西轻工业，2007，6：5-6；李慧芬，等.陕西农业科学，2006，5：77-80]。目前，已报道的主要活性菌物多糖有香菇、猴头菇、灵芝、银耳、黑木耳、冬虫夏草、灵芝多糖、灰树花等。然而，由于多糖复杂的结构与组成，其质量控制一直是其应用开发的瓶颈。多糖的分子量、组成单糖、构象及糖苷键链接等与其活性密切相关，如何快速准确地鉴别及定量分析多糖是多糖产业化过程中的关键问题。为此，我们先后建立了基于多糖特异酶解反应及其产物特征的多糖“糖谱法”[中国专利ZL200910031276.5]和基于多糖dn/dc值的多糖定量方法[中国专利ZL201410172342.1]。由于分离鉴定技术对糖谱法准确鉴定不同来源多糖至关重要，而dn/dc存在无法克服共流出多糖组份对定量准确性的影响。为此，本发明采用针对活性多糖结构特征的定性鉴别及定量分析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于酶解特征寡糖片段的高分离度的多糖测定分析方法。

为实现上述目的，本发明提供一种多糖测定分析方法，包括以下步骤：

(1)多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；

(2)衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；

(3)测定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息。

具体地，步骤(1)中所述内切酶选自β-1,3(4)-葡聚糖内切酶、β-1,3-葡聚糖内切酶、β-1,4-半乳聚糖内切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶和异淀粉酶中的一种或多种。每1mg多糖所使用的酶的用量范围为1～650U。内切酶的类型可根据所测多糖样品中结构特征进行选择，如香菇多糖中糖苷键主要含β-1,3-葡聚糖苷键，就选择β-1,3-葡聚糖内切酶水解香菇多糖。

具体地，步骤(2)中所述衍生化试剂选自2-AB(2-氨基苯甲酰胺)、2-AA(2-氨基苯甲酸)、ABBE(对氨基苯甲酸酯)、AMAC(2-氨基吖啶酮)、ANTS(8-氨基萘-1,2,6-三磺酸)、APTS(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸盐)、3-AQ(3-氨基喹啉)或2-AP(2-氨基吡啶)。衍生化是指采用还原胺化、与吡唑啉酮类、肼类试剂反应、氨基衍生化、羟基衍生化、羧基衍生化，衍生化试剂具体根据所测多糖样品需进行的衍生化操作进行选择。

具体地，步骤(2)包括以下步骤：

a)将衍生化试剂溶于DMSO/乙酸溶液中，获得的衍生化试剂浓度为0.01-0.2M；

b)用步骤a)中获得的衍生化试剂溶液配制硼氢化钠溶液，使得硼氢化钠的最终浓度为0.1-1M，配制完成后获得所述衍生化试剂溶液；