[发明专利]一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法

说明书

本发明公开了一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括黄曲霉孢子悬液的配制、拮抗菌的初筛、拮抗菌的复筛得到拮抗菌；通过形态学特征、生理生化特征、16SrDNA及gyrB基因序列分析对其进行鉴，筛选出一种对黄曲霉菌有明显抑制的菌株B10，经鉴定确认B10菌株为解淀粉芽孢杆菌。为防控黄曲霉毒素B₁真菌毒素中毒提供新的方法和理论依据，该发明具有重要的生产实践意义。

技术领域

本发明菌株筛选鉴定技术领域，具体涉及一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法。

背景技术

黄曲霉属于曲霉属，其污染多种重要的植物及植物产品，对人畜的健康造成了威胁。黄曲霉可以导致人类曲霉病，其危害率仅次于烟曲霉菌。Adekoya等从被霉菌毒素污染的玉米酒中发现黄曲霉发病率最高，为26％。由黄曲霉感染而导致的曲霉病越来越常见，其主要感染患者的肺部、指甲、脊髓等器官，导致神经麻痹。黄曲霉菌产生的次级代谢产物被称为黄曲霉毒素。黄曲霉毒素在人类中显示出急性和慢性毒性。黄曲霉毒素是一组对人类和动物有健康危害的有毒，致突变，致癌和致畸的次级代谢物。黄曲霉毒素AFB1是目前所知天然化合物中毒性最大的，根据其毒性对人类产生的致癌性和威胁，国际癌症研究机构(IARC)将其归类为一类毒素。

常见的物理法和化学法对黄曲霉菌的抑制及其毒素的去除有很大的作用，但是会引发很多问题，比如化学残留问题，这些问题导致越来越受到人们关注。近些年来，生物防治因为其专一性、环境友好、处理条件温和、易于产业化等原因受到越来越多的专家关注。Hua通过试验发现酵母菌可以抑制黄曲霉菌的生长。在喷洒了酵母菌株的植株上接种黄曲霉，能有效抑制黄曲霉在果实上定殖，其孢子数量比对照降低60％-90％不等。郭春兰把玉米圆斑病菌经枯草芽胞杆菌发酵液处理后，发现玉米圆斑病菌孢子萌发率降低，菌丝和孢子产生畸形，不能正常发育。王小兵等从花生植株茎秆中分离出的解淀粉芽抱杆菌对花生青枯病的致病菌有显著的拮抗作用，田间试验表明对花生青枯病的抑制率为62.4％。张盼从纳豆中筛选出一株芽孢杆菌，发现其菌株发酵上清液对黄曲霉毒素的的降解率高达85.73％。其抗菌活性物质粗提物对黄曲霉毒素的降解率达91.4％。宫小明等筛选的枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌可以明显的抑制黄曲霉孢子的萌发，并且也抑制了菌丝的生长，其培养液对黄曲霉毒素的产生分别降低了99.06％和99.30％。

发明内容

本发明的目的是分离鉴定出能够抑制黄曲霉生长及产黄曲霉毒素B1的益生菌株，为防控黄曲霉毒素B1真菌毒素中毒提供新的方法和理论依据，该发明具有重要的生产实践意义。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括以下步骤：

(1)黄曲霉孢子悬液的配制

将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72-96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至10⁷cfu/mL，黄曲霉孢子悬液做到现配现用；

(2)拮抗菌的初筛

将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出具有拮抗作用的初筛的菌株；

(3)拮抗菌的复筛