[发明专利]一种针对EGFRvIII的多功能融合蛋白及其应用

权利要求书

1.一种针对EGFRvIII的多功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括识别肿瘤抗原EGFRvIII的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白的胞外功能区、结合免疫细胞的功能区以及用于连接功能区的非功能性氨基酸片段。

2.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述识别肿瘤抗原EGFRvIII的抗体为EGFRvIII抗体scFv；所述肿瘤表面免疫抑制蛋白为CD47，屏蔽CD47的胞外功能区为SIRPα，其肿瘤细胞抑制性免疫检查点通路是指CD47/SIRPα抑制信号的通路；所述免疫细胞的结合区为其表面的Fc受体，结合所述Fc受体的抗体为高亲和力人抗体IgG1Fc。

3.根据权利要求2所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述SIRPα的氨基酸序列为SEQID NO：1所示序列；所述EGFRvIII抗体scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述IgG1Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列。

4.根据权利要求3所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述SIRPα的氨基酸序列为SEQID NO：1所示序列中的31-150位点或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体；所述EGFRvIII抗体scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列中的1-242位点或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体；所述IgG1Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列中的3-219位点或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体；所述用于连接功能区的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体或重复序列。

5.根据权利要求2所述的的多功能融合蛋白，其特征在于，所述多功能融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列或具有类似功能的至少90％相似序列的突变体。

6.根据权利要求5所述的多功能融合蛋白，其特征在于，制备所述融合蛋白的步骤包括：

步骤1)通过人工合成的方式合成SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或具有类似功能的至少90％的相似序列相对应的碱基，组成融合蛋白构造基因；

步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因转入哺乳动物表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞进行蛋白表达；

步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，通过层析纯化后制得重组融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的的多功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白构造基因的构建步骤包括：根据SIRPα，抗EGFRvIII scFv和IgG1Fc的功能区氨基酸相对应的碱基，通过基因合成与非功能氨基酸片段碱基连接成多功能融合蛋白构造基因；

其中，所述SIRPα，抗EGFRvIII scFv和IgG1Fc的功能区氨基酸分别为SEQ ID NO：1所示序列中的31-150位点或或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体、SEQ ID NO：2所示序列中的1-242位点或或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体、SEQ ID NO：3所示序列中的3-219位点或或含有至少与所述位点90％相同序列的突变体；所述非功能氨基酸片段的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列或含有至少与上述位点90％相同序列的突变体或重复序列。

8.一种如权利要求1～7中任一项所述的多功能融合蛋白在制备治疗表达CD47和EGFRvIII肿瘤而引起的疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为多功能融合蛋白的单独应用或与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成的联合应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括具有EGFRvIII突变的实体瘤，其中所述实体瘤包括脑胶质瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌、肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌。