[发明专利]鼻腔脱落细胞RNA的提取方法

说明书

本发明提出一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括以下步骤：获取鼻腔脱落细胞，将所述鼻腔脱落细胞加入RNA抽提液中，混合后加入第一溶剂混合，震荡均匀后静置，经第一次离心处理得上清液，取上清液加入第二溶剂混合，经第二次离心处理后保留第一沉淀，取第一沉淀继续加入第三溶剂混合，经第三次离心处理后保留第二沉淀，再经第四次离心处理保留沉淀，加入去RNA酶及去DNA酶的水溶解沉淀后得到RNA。本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，构建了一个新的检测方法，避免进行病理活检，因此可以在不同随访阶段取样，进行患者病程追踪，提供了一种无创的方法获得患者鼻腔上皮细胞，避免了患者的感染风险。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及鼻腔脱落细胞RNA的提取方法。

背景技术

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)是鼻窦黏膜的慢性炎症，查体可见鼻腔或中鼻道息肉形成。CRSwNP常见症状为鼻堵、流涕或鼻涕倒流、嗅觉减退、面部闷胀感或压力感，持续时间超过12周。患病率约为0.5-4％，CRSwNP常伴有哮喘和过敏性鼻炎，有报道7％的哮喘患者患有CRSwNP,而26-48％的CRSwNP患有哮喘。CRSwNP发病机制目前还不确定，黏膜上皮细胞破坏、宿主免疫系统失衡和病原微生物入侵可能是其发病的主要原因。CRSwNP主要的治疗方式是手术和药物治疗。但研究表明，即使通过规范的药物或手术治疗，慢性鼻窦炎伴鼻息肉的复发率仍高达56％，严重影响患者生活质量，同时带来高额医疗支出，但临床却缺乏根治性治疗方法，因而成为鼻科学研究领域的重点。

依据嗜酸性粒细胞浸润的程度可以将CRSwNP分为嗜酸性粒细胞型(EosinophilicCRSwNP,ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型(Noneosinophilic CRSwNP,nonECRSwNP)，二者的临床表现、用药和预后均不同，嗜酸性粒细胞型的临床症状较重，以鼻堵和嗅觉减退为主，多合并有哮喘，术后复发率较高。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润程度与复发关系最为密切，当组织中该细胞百分比超过27％时，复发风险超过90％。嗜酸性粒细胞型息肉对糖皮质激素类药物的敏感度显著高于非嗜酸性粒细胞型。非嗜酸性粒细胞型临床症状一般较轻，且合并哮喘的几率较小，气道炎症较轻，且术后复发率较嗜酸性粒细胞型低，对大环内酯类药物治疗反应好。西方国家以嗜酸性粒细胞型为主，主要表现为TH2炎症反应，而我国的嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型比例均约占一半，主要表现为TH1/TH17炎症反应为主。综上所述，嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型在免疫病理类型、临床症状、药物治疗反应和预后存在明显不同。不同慢性鼻窦炎伴鼻息肉的炎症/病理分型治疗策略不同。所以对慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分型的鉴定显得尤为重要。

目前对两种亚型的判断主要依据鼻腔黏膜活检后组织病理标本染色，缺乏无创性生物学标志物用于鉴别诊断。患者在鼻内镜下获得息肉标本后，进行石蜡固定等病理标本的常规处理，然后进行苏木素伊红的染色，接下来通过高倍显微镜观察组织浸润的炎细胞(主要的炎细胞包括嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)浸润个数，进行细胞分型。然而现有的该方法存在以下问题：该方式为有创检查，增加了患者的感染风险，不适用于免疫力较低人群如儿童、老年人等；而取材时鼻腔出血，往往引起患者恐惧和担忧；另外通过该方法难以获得疾病的实时动态变化信息：不能在术后对愈合期黏膜进行病理活检。但临床数据表明慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分类会随药物治疗、手术治疗等转归，用治疗前的病理活检结果无法代表全部疾病时期的特征；同时组织病理切片较局限，只能反映切片位置的标本炎症状态，不能反映组织的全貌，可能会造成误诊，而且每张片子都需要病理科医生人工计数，难以批量操作。