[发明专利]一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法

说明书

本发明涉及一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，属于生物化学实验技术领域，包括安装凝胶盘、琼脂糖凝胶的制备、灌胶、加样、观察等步骤，使用新型核酸染色GelRed试剂(Biotium)，取消EB染色步骤，操作简便易掌握、实验结果条带清晰，实验过程试剂无毒、低致突变性，提高了胶带染色效果和时间效率，同时保证操作人员的健康和实验环境的安全性。

技术领域

本发明属于生物化学实验技术领域，具体涉及一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法。

背景技术

近年来，分子生物学得到迅猛发展，聚合酶链式反应(PCR)是一种简便、准确的核酸定量检测技术。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法，是分子生物学的核心技术之一。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具有亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下(pH8.0的缓冲液)带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组的目的。

EB是实验室最常用的核酸染料，能使凝胶中的DNA和RNA很好地着色，从而显示凝胶中核酸的位置。但其具有毒性强、强致突变性、中度致癌性、难以降解转化和净化处理繁琐，对实验者和周围环境都有着较大的危害。

发明内容

为了克服背景技术中的技术问题，本发明提出一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其将新型核酸染料GelRed试剂(Biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液按1:3000～5000比例配成混合液添加至PCR扩增产物中，实现核酸电泳与染色同时进行，从而取消传统核酸电泳过程的PCR扩增产物染色这一过程，但是却更有利于观察。

一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，包括以下步骤：

步骤1安装凝胶盘，包括：

将量筒、三角瓶、凝胶盘以及齿试样格洗净并晾干；将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封；将凝胶盘置于水平桌面上，并插上齿试样格；

步骤2琼脂糖凝胶的制备，包括制备

用量筒量取5×TBE电泳缓冲液40mL加水至200mL，配置1×TBE稀释电泳缓冲液并倒入三角瓶中；

称取1g-4g Invitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液，盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间1min；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间为90s；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，直至有大气泡产生时停止，继续放入微波炉，直至琼脂糖完全溶解；

步骤3灌胶，包括

将磁力搅拌子放入三角瓶中，并将三角瓶置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却；待三角瓶内的琼脂糖溶液温度冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢地倒入凝胶盘中，以免产生气泡；在每份10μL DNA样品PCR扩增产物中加入5μL GelRed试剂(Biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液，放置待用；其中3×稀释凝胶加样缓冲液和GelRed试剂按3000～5000:1比例进行混合；将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000mL1×TBE稀释电泳缓冲液于电泳槽内；45-60分钟待凝胶凝固后，撕开胶带密封纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，并将齿试样格洗净；

步骤4加样，包括

吸取3μL DNA样品PCR扩增产物、GelRed和3×凝胶加样缓冲液的混合液加入胶孔中，在待测样品左侧的样品孔中加入3μL的DNA分子量标记，用作分子量参照；