[发明专利]蝶蛹金小蜂毒液Kazal-type丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPI24蛋白及应用

说明书

本发明公开了一种蝶蛹金小蜂毒液Kazal‑type丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSPI24，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蝶蛹金小蜂毒液Kazal‑type丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSPI24的基因，其具有SEQ ID NO：1中第70‑231位的核苷酸序列。本发明的抑制剂能用于抑制菜粉蝶或柑橘凤蝶血淋巴PPO的激活。本发明还同时公开了一种提高十字花科蔬菜对鳞翅目害虫预防力的方法，包括用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因转化十字花科蔬菜细胞，再将转化后的十字花科蔬菜细胞培育成植株。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的Kazal-type丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSPI24及其编码的核酸序列和应用。

背景技术

害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也是一直制约农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计2014年全国病虫害发生面积年约55亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮食损失约占总产的15％-20％，即便如此，每年粮食损失仍可达300亿～500亿斤。

自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有效控制出现了新机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到2014年的1.8亿公顷(其中抗虫的占43％)，其中也产生了明显的经济与生态效应。

但是，随着仅有单一Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问题也随之日趋备受关注，且这种担忧已在Bt棉田的美洲棉铃虫Helicopera zea上已出现迹象。为此，不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物(主要是蝎子、蜘蛛)中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫生物防治作用物，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染方面有着重要作用。寄生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)、类病毒颗粒(virus like particle，VLP)、类病毒纤丝(virus likefilament，VLF)、卵巢蛋白(ovarian protein，OP)、畸形细胞(teratocyte))，以破坏寄主免疫反应、调节寄主生长发育、调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，已成功将藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，并使烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。Rodriguez-Andres等将毁侧沟茧蜂(Microplitis demolitor)寄生因子PDV中的Egf1.0蛋白导转入塞姆利基森林病毒Semliki Forest virus中，可以显著促进病毒的增值，增强其对埃及伊蚊Aedes aegypti的致死效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制血淋巴黑化)的蝶蛹金小蜂毒液Kazal-type丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PpSPI24及其编码的基因和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂PpSPI24，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

备注说明：SEQ ID NO：2包含了信号肽。