[发明专利]一种抗虫基因T-DNA载体及其应用

说明书

本发明公开了一种抗虫基因T‑DNA载体的构建及其应用。本发明将一个复合启动子用于启动一个抗虫基因的表达，所述的复合启动子包含有花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以及水稻肌动蛋白Actin1的内含子序列。所述的抗虫基因由Cry1Ab和Vip3A通过连接肽连接构成。本发明所述的重组载体构建完成后转入玉米，转基因玉米中抗虫蛋白的表达量显著提高。本发明的重组载体可用于制备抗虫植物细胞，所述植物包括玉米、水稻等。利用本发明的重组载体转化得到的转基因植物，可以高效杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等主要鳞翅目害虫。

(一)技术领域

本发明涉及一种抗虫基因T-DNA载体的构建及其应用。

(二)背景技术

害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失，害虫的防治目前主要依靠使用化学农药，但是农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害，目前转基因抗虫玉米、棉花等已经大量推广种植。

转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。比较常用的是BT杀虫晶体蛋白，如Cry1Ab、Cry1C等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物；近年来在BT中发现的另一种营养期杀虫蛋白也被证明具有较好的抗虫活性，如Vip3A等。单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄；同时，长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，还可能引起害虫抗性的产生和发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高表达抗虫蛋白的重组载体的DNA序列及其构建方法，以及在获得转基因抗虫农作物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种抗虫基因T-DNA载体，所述T-DNA载体包含了一个具有花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以及水稻肌动蛋白Actin1内含子序列来启动抗虫基因表达的完整表达框，具体所述T-DNA载体包含抗虫基因表达框，所述抗虫基因表达框是由抗虫基因、复合启动子和终止子拼接构成；复合启动子由CaMV 35s和Actin-intron拼接而成。

进一步，所述的抗虫基因由Cry1Ab和Vip3A连接而成。

进一步，所述抗虫基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列(SEQ IDNO:1所示)与编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列(SEQ ID NO:2所示)通过连接肽基因序列连接构成，完整的抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

进一步，所述CaMV 35s核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示，所述Actin-intron核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示。

进一步，所述终止子为终止子Pepc-ter，核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示。

本发明所述T-DNA核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示。

本发明还涉及一种所述抗虫基因T-DNA载体在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为单子叶植物，优选为玉米或水稻。

本行业的技术人员均知道以下理论：

1)一种用于制备抗虫植物细胞的转化载体中必须包含整个抗虫基因的表达框，由启动子、基因、终止子三个组件构成；

2)并非任意的启动子都能高效启动抗虫基因的表达，不同的启动子对于抗虫蛋白的表达效果相差很大。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)由CaMV 35s与水稻肌动蛋白Actin1内含子序列拼接而成的复合启动子，可以高效启动抗虫基因的表达；