[发明专利]SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法

说明书

本发明提供了一种SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，通过选用4~5周龄的SD大鼠为原体，剥离胃窦组织后，在Ⅱ型胶原酶的作用下，经过离心操作分离出ICC细胞，在M199完全培养基中培养后，再经过消化操作和离心处理，得到分离好的ICC细胞。本发明所述的方法，选用4~5周龄（110±10g）的SD大鼠作为实验动物，避免了由于成年大鼠ICC细胞的高度分化，而造成细胞获得率低的弊端，同时本发明调整了Ⅱ型胶原酶的浓度，避免了低浓度长时间消化或者高浓度短时间消化对细胞造成的损伤；采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，避免了由于梯度离心对脆弱的细胞造成损伤。

技术领域

本发明属于细胞提取方法领域，具体是涉及到SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法。

背景技术

胃窦间质细胞（ICC）是作为胃肠运动的起搏细胞，可以产生自主节律性慢波电位，通过突出及缝隙连接作用于胃肠的平滑肌细胞，促进平滑肌的节律性舒缩。而多种胃肠病如慢性传输型便秘、功能性消化不良、糖尿病胃轻瘫等均与ICC的病理变化有关。现有的ICC原代细胞提取技术，多是采用成年SD大鼠，用Ⅱ型胶原酶消化，梯度离心法进行纯化。但这种方式不能避免成年大鼠ICC细胞高度分化，不能避免梯度离心对细胞的损伤和丢失。

发明内容

本发明针对现有ICC细胞分离方法的缺陷，采用幼年4~5周龄（110±10g）的SD大鼠作为实验动物，采用细胞接触抑制及优势竞争的原理进行提纯，采用含有干细胞因子（SCF）的完全培养基进行培养，可以稳定、持续、高效获得高表达率的ICC细胞。

本发明通过以下技术方案得以实现。

SD大鼠胃窦间质细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

S1、初步分离

选用4~5周龄的SD大鼠，禁食不禁水12h后，采取乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼发处死；用75%乙醇湿润腹部，无菌条件下打开腹腔，取出胃窦，沿胃小弯剪开，置于无菌玻璃皿内，使用温度为3-5℃的PBS液反复冲洗3次，快速更换无菌玻璃皿并置于冰上，加入适量PBS液，解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊锐性分离胃粘膜及粘膜下层，将剥离后的组织置于含有M199完全培养基的试管中，并放于冰下，以保持细胞活性；

S2、分离出ICC细胞

将步骤S1中剥离好的胃窦肌层组织放于无菌安倍瓶里，加入2-3倍体积的M199完全培养基，置于冰上，并用眼科镊快速的将组织剪碎成大小为1mm3的组织块，将组织块移至无菌试管中，加入6-10ml M199完全培养基，于冰上静置5min，去掉上清液，加入Ⅱ型胶原酶3-5ml，盖紧试管盖并用封口胶封口，水浴锅36-37℃中消化35~40min，水平放置，每10min观察组织块消化情况并轻柔的摇晃试管使组织与液体充分接触，进行离心操作，加入M199完全培养基5ml，用粗口试管缓慢吹打6~10min，用200-300目筛网过滤，得到细胞悬液，移入细胞培养瓶中，十字法摇匀细胞悬液，使其分布均匀；

S3、提纯ICC细胞

将步骤S2得到的分布均匀的细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，8h后观察细胞贴壁情况，并弃细胞培养液，使用D-hanks液洗2次，加入4ml M199完全培养基，第一次换液后，每24h观察细胞形态，每48h换液一次；第一代细胞于第7天到对数生长期，观察并传代，进行消化操作后，倒置显微镜下观察消化情况，待细胞明显收缩、细胞间隙增加时，加入3mlM199完全培养基终止消化，轻轻沿瓶底吹打2min，收集细胞悬液于离心管中，1200r/min离心5min，去掉上清液，得到分离好的ICC细胞。

进一步的，所述步骤S1中，剥离组织的要求为：应该快、准，减少对组织的损伤，以锐性分离为原则操作，每只胃窦处理时间控制在10分钟内，在冰上操作。

进一步的，所述步骤S1中使用到的PBS液中含有2%的青霉素-链霉素溶液。