[发明专利]靶向CD19和EBNA1基因修饰的T细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具公开了一种同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞。所述T细胞同时具有靶向CD19的CAR和靶向EBNA1的TCR，其不仅可以靶向识别表达CD19的肿瘤细胞，而且在CD19低表达或不表达时，可以靶向识别表达EBNA1的肿瘤细胞，从而为EBV阳性B细胞来源的肿瘤提供一种新的治疗手段。而且，本发明优化了该基因修饰T细胞的培养过程，提高该基因修饰T细胞识别EBNA1的比例。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，靶向CD19的CAR-T在治疗复发，耐药，难治B细胞白血病和淋巴瘤方面取得了举世瞩目的成就，引起世界各国肿瘤临床医生的极大兴趣。但是仅靶向CD19的CAR-T治疗B细胞来源肿瘤会导致肿瘤细胞CD19低表达或不表达，从而导致肿瘤细胞免疫逃逸而产生复发和耐药。因此同时靶向CD19的CAR和靶向EBNA1的TCR可以同时靶向B细胞来源的EBV阳性肿瘤的CD19和EBNA1两个靶点，因此对于B细胞来源EBV阳性肿瘤尤其是CD19 CAR-T治疗失败的患者，双靶点基因修饰T细胞预期会取得较好的治疗效果。CD19是B细胞系的细胞，包括正常的B细胞，前B细胞，B细胞淋巴瘤和白血病细胞，特异性表达的膜蛋白,其他细胞和组织都不表达CD19；而EBNA1是所有EBV阳性肿瘤均表达的蛋白。因此，对于B细胞来源EBV阳性肿瘤尤其是CD19 CAR-T治疗失败的患者，双靶点基因修饰T细胞会取得较好的治疗效果。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明培养一种同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞。

本发明将靶向CD19的CAR构建于慢病毒载体进而转入患者T细胞，使该基因修饰的T细胞可以靶向识别表达CD19的肿瘤细胞。但是仅靶向CD19的CAR在B细胞来源肿瘤的治疗中易导致肿瘤细胞CD19的低表达乃至不表达，因此易导致疾病进展乃至复发。但由于部分B细胞来源肿瘤会感染EBV，而感染EBV的肿瘤细胞会表达EBNA1，因此将靶向CD19的CAR感染患者外周血T细胞后，应用商品化的EBNA1抗原肽对其进行两周期体外刺激，以期靶向CD19的CAR-T亦能特异识别EBNA1，最终同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞预期会有更强的治疗效果。

第二方面，本发明提供上述双靶向T细胞的制备方法：将EBNA1抗原肽负载DC细胞，获得负载抗原肽的DC细胞；将负载抗原肽的DC细胞与靶向CD19的CAR-T共培养，即获得同时靶向CD19和EBNA1的基因修饰T细胞。

其一，靶向CD19的CAR-T的构建方案为：将靶向CD19的CAR构建于慢病毒载体，进而转入T细胞。具体步骤如下：

(1)合成表达靶向CD19的CAR的核苷酸序列,合成所述基因时在其两端分别包含XbaI和SalI酶切位点，并将其装载在质粒上；

(2)利用XbaI和SalI双酶切步骤(1)所述质粒，切胶回收目的基因片段；

(3)利用XbaI和SalI双酶切慢病毒原始载体，切胶回收的载体片段；

(4)利用DNA连接酶将步骤(2)回收的目的基因片段与步骤(3)回收的载体片段连接，即得。

由于慢病毒感染外周血T细胞的效率普遍不高，为了促进靶向CD19的CAR在T细胞中可进行高效的表达，本发明进一步优选了慢病毒载体启动子种类，以求对T细胞发挥最佳的感染效率。启动子EF1α，使得该慢病毒载体产生的慢病毒可以高效感染外周血T细胞，而且靶向CD19的CAR可以高效表达于该T细胞表面。