[发明专利]温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法

说明书

本发明涉及一种温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法。本发明的温敏阳离子纳米凝胶特点在于：采用了烷氧醚树枝化基元作为温敏基元，具有较高的温度敏感性和接近人体体温的相变温度，以及良好的生物相容性；其次同样采用树枝化结构的阳离子氨基基元，使其具有对于siRNA的更强的吸附能力。因此，合成的纳米凝胶其可以有效的实现siRNA的结合和保护作用，并在此基础上通过温度开关实现对siRNA的结合和释放功能的调控。本实验为该材料在生物材料、siRNA递送和基因治疗领域等方面的应用具有指导意义。

技术领域

本发明涉及一类温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法与应用。

背景技术

RNA干扰是生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA启动的序列特异的转录后基因沉默过程，通过导入外源或内源的双链RNA（dsRNA），细胞内加工后可以特异性阻滞基因的表达，使内源性信使RNA（mRNA）发生特异性降解，从而引起转录后基因沉默。其具体的作用机制为前体RNA经过一种核糖核酸酶切割，形成长度为21 -23个碱基对序列的双链小RNA分子或者是直接插入人工合成的类似长度的siRNA,在细胞内经过RNA诱导沉默复合物的识别后，siRNA中的正义链被去除，反义链与含其序列互补的mRNA进行结合，从而引起目的基因的降解。

但是，siRNA由于其在体内易被核酸酶分解、细胞吸收效率低等因素导致其难以独立完成基因治疗的任务，因此优异的siRNA载体材料近年来受到科学家的广泛关注。并且由于非病毒载体具有低的免疫反应，对结构和功能具有更好的调节能力，合成较为简单和材料来源广泛等优点，也是在siRNA的递送中作为载体展现出了非常良好的潜力。而近年来针对其非病毒载体的研究主要包括阳离子纳米凝胶载体。

纳米凝胶是一种以水为分散介质通过物理或化学交联形成的具有溶胀性且内部具有三维网状结构且直径在200纳米以下的纳米结构，而且具有血液循环时间长、生物相容性好及生物可降解性等优点。阳离子纳米凝胶载体由于可通过静电作用与siRNA结合且由于“质子海棉效应”的存在使其具有较好的细胞内化和溶酶体逃逸的能力，相较与其他非病毒载体具有较好的细胞转染能力，所以利用它作为载体是目前聚合物载体研究的热门。随之也可以通过对凝胶进行表面修饰制备出具有刺激响应性的可生物降解的纳米凝胶，因此纳米凝胶成为siRNA载体研究的又一大热点。Ahmed等以具有温敏效应的阳离子单体为核心和以具有良好生物相容性和可降解性的含糖共聚物为壳形成阳离子多糖纳米凝胶，并且对这俩种单体使用对酸不稳定的交联剂进行可控活性自由基聚合使得该凝胶同时具有温度和pH双重响应的机制，有效地提高了siRNA递送效率，且将这种阳离子凝胶与细胞内皮生长因子siRNA结合能够有效抑制人类宫颈癌细胞表面65%的细胞内皮生长因子。该方法有效地结合了天然多糖类聚合物和人工合成聚合物的优势大大提高了转染效率，为后续的研究提供了良好的思路（M. Ahmed, et al.Polym Chem. 2013, 4, 3829-3836）。

近年来，一方面我们对siRNA递送过程各个阶段中的种种障碍有了一定的了解，也产生了很多对提高各个阶段效率的方法，但是这样的策略结合到一起往往却是相矛盾的，例如对载体表面聚乙二醇修饰可以提高血液流通时间却会降低转染能力，所以近年人们逐渐集中投身对于刺激响应性“智能载体”的研究当中。但是由于人体对于温度响应的灵敏性较低，因此，人们对于温度敏感性的siRNA载体缺少足够的研究研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类温度敏感型siRNA纳米凝胶载体。

本发明的目的之二在于提供该载体的制备方法。

本发明通过分子设计制备出以具有优异温敏行为以及良好生物相容性的烷氧醚树枝化基元为基础，并且引入树枝化阳离子基元分别通过沉淀聚合方式得到具有一定拓扑结构的新型阳离子树形纳米凝胶。研究制备的新型阳离子树形纳米凝胶能够借助树枝化烷氧醚基元优异的温敏特性和拓扑结构，实现以温敏调控的手段实现对siRNA的结合和释放。