[发明专利]一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌

说明书

一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌，通过利用克隆的桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶基因IDP与表达载体可操作地连接，得到能够表达该蛋白的重组表达载体，并将上述重组表达载体导入恰当的宿主细胞中而获得。本发明还提供一种制备上述IDP的方法，其是通过培养IDP‑X33，经甲醇诱导表达获得桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶IDP。所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养96小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。本发明的提供的重组毕赤酵母表达二肽酶方法，胞外分泌酶活达到24U/mL，细胞密度(OD₆₀₀)为24.5，酶的分泌效率为1U/mL。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌。

背景技术

二肽酶是一类作用于二肽肽键的外切水解酶类的统称，主要是作用于由肽键连接的两个氨基酸残基所组成的二肽化合物，属于外肽酶中羧肽酶的一种类型。

近年来利用二肽酶的逆向催化作用，可以合成一些有价值的二肽，并广泛的应用于饲料、食品及医药行业中。例如：在早期断奶仔猪日粮中添加适量谷氨酰胺二肽，以肽形式吸收Gln，克服游离Gln因热不稳定性及溶解度低等造成的吸收率差的缺点，可缓减仔猪断奶的应激，提高断奶仔猪生长性能和免疫能力，降低腹泻率。利用天冬氨酸二肽酶可制备甜味剂，与化学合成相比，不仅不污染环境，还大大提高了合成效率。丙谷二肽属于氨基酸类的化学药剂，其作为氨基酸类肠外营养剂，对处于生命危急时刻的病人起着重要作用，有资料显示，及时补充丙谷二肽，可以显著缩短病人住院治疗和恢复的时间，药用价值的特殊性，就像生理盐水、葡萄糖一样，将成为救护病人的必需品，具有医疗和经济的双重意义。

发明内容

本发明从桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株中克隆到去跨膜区的二肽酶基因IDP，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为1326bp，分析表明，GC含量为49％，编码442个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白大小48kDa，等电点预测为6.25。

将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明IDP的基因工程菌。

根据TMHMM2.0预测DP氨基酸序列的跨膜区显示，在55-77位氨基酸左右具有一个跨膜区结构，如图1所示。通过BamH I和Not I双酶切巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA，并通过PCR分别扩增去跨膜区后的两个片段IDP1和IDP2，大小分别为162bp和1164bp。将IDP1和IDP2融合后插入到双酶切后的pPICZαA上构建得到含IDP的表达载体IDP-pPICZαA。进一步将该表达载体转到巴斯德毕赤酵母X-33中并筛选获得含IDP基因的能够表达IDP的基因工程菌IDP-X33。实验表明由该基因编码的二肽酶最适反应温度为50℃，最适反应pH值为7.2，将该去跨膜区的桦褐孔菌二肽酶命名为IDP。

本发明还提供一种制备上述IDP的方法，其是通过培养IDP-X33，经甲醇诱导表达获得桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶IDP。所述培养条件为28℃，初始pH为7，200rpm培养96小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。

本发明的有益效果：本发明的胞外分泌表达表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌可胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶，为工业化生产桦褐孔菌二肽酶奠定了基础；本发明的制备二肽酶的方法，胞外酶活可达24U/mL，细胞密度(OD₆₀₀)为24.5，胞外分泌效率可达1U/OD₆₀₀。

附图说明

图1TMHMM分析DP氨基酸序列跨膜区；