[发明专利]一种体液来源的肿瘤细胞的高效培养方法及其应用

说明书

本发明涉及一种体液来源的肿瘤细胞的培养方法和肿瘤培养基。所述方法为富集体液肿瘤细胞，与细胞外基质混合，在基本培养基的存在下，加入相应的胸水、腹水或脑脊液等进行3D细胞培养。此方法能高效获得病人来源的肿瘤类似物(Patient Derived Tumor analog,PDTA)，为检测临床肿瘤病人对药物的敏感程度以及测定候选药物的体外代谢稳定性、代谢谱、毒性等提供一种新型的检测工具。

技术领域

本发明涉及体液来源的肿瘤细胞的培养领域，具体涉及多种胸水、腹水或脑脊液肿瘤细胞的培养方法、肿瘤细胞培养基及其应用。

背景技术

目前用于肿瘤学基础科学研究的模型主要有肿瘤细胞系和人源肿瘤异种移植模型。其中肿瘤细胞系具有培养周期短、易于操作、费用较低等优点，其缺点有：1）肿瘤细胞系是在2D条件下培养获得的，与体内环境相差较大；2）肿瘤细胞系的遗传背景和基因表达谱与临床患者肿瘤细胞有较大差异。因此，肿瘤细胞系通常只用作基础探索性研究工具。人源肿瘤异种移植模型（patient-derived xenograft model，PDX模型）是指将病人的肿瘤组织手术切下来后，接种在免疫缺陷的小鼠体内，在小鼠身上成瘤并进一步传代的肿瘤模型。PDX模型能够保留肿瘤患者的组织型和遗传学特征，并能维持肿瘤的异质性。其缺点有：1）培养周期长，从肿瘤组织获取到接种、传代、实验，通常需要数月时间；2）需要专门的免疫缺陷小鼠和动物培养场所，费用昂贵；3）实验动物对药物的反应性等与人类有较大差异。

近年来，随着干细胞技术的发展，Hans Clever等建立了一种体外3D培养干细胞获得组织类器官的方法。类器官是指将具有干细胞潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的类似组织，并具有自我更新和自我组织的能力，维持了其来源组织的生理结构和功能的特点，也被称作“瓶皿里的器官”。研究表明，类器官在传代的过程中显示出高度的遗传稳定性，如单个肝脏干细胞生成的肝类器官，经三个月的传代后，全基因组测序显示仅出现了一个同源碱基的替换。截止目前，正常组织类器官培养已用于肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺等组织，主要被用于器官发育生物学、细胞生物学、再生机制等领域的研究。CN102439135B公开了上皮正常组织快所含干细胞类器官培养和上皮腺瘤组织块来源的肿瘤细胞3D培养，但是对体液来源的，尤其是胸腹水肿瘤细胞分离，及3D肿瘤类似物的培养没有涉及。

胸水、腹水、脑脊液等体液的过多积聚是临床常见的病理现象，多由转移性恶性肿瘤形成。CN104962520 A公开了从从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，但没有涉及胸腹水肿瘤细胞的培养方法；CN106190980 A公开了一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤细胞的方法及其专用培养基，其使用的仍然是普通体外培养基和人工加入的部分细胞因子，不能很好的体现体内环境，影响检测数据的准确性和真实性，对于达到临床治疗目的有一定的差距。综上，在现有技术中，尚缺乏从肿瘤病人的胸水、腹水、脑脊液等体液中分离肿瘤细胞，并在3D条件下，利用可模拟肿瘤细胞体内环境的培养基进行肿瘤类似物培养的方法。因此，改善肿瘤细胞体外培养技术，是现在亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种从体液中提取肿瘤细胞体外培养肿瘤类似物的方法并提供培养基。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种肿瘤细胞的培养方法，所述方法包含：富集体液肿瘤细胞，与细胞外基质（如3D-基质胶）混合，在培养基的存在下，加入相应的体液上清液。

一种肿瘤类似物的培养方法，所述方法包含：富集体液肿瘤细胞，与细胞外基质（如3D-基质胶）混合，在培养基的存在下，加入相应的体液上清液。

进一步的，富集体液肿瘤细胞的方法为：取胸水、腹水或脑脊液样本，离心后得到细胞沉淀物，同时收集上清，过滤去除杂质，56℃水浴灭活20-40min，优选30min。体液上清液的浓度为0-50%。所述细胞外基质为3D-凝胶质。