[发明专利]一种双壳贝类精子质量检测的方法

说明书

本发明提供了一种双壳贝类精子质量检测方法，该方法结合荧光染料双染与流式细胞术来检测双壳贝类精子质量，包括如下步骤：首先调整精液浓度，然后以透膜的荧光染料及不透膜的荧光染料与待测精液进行染色，室温孵育，流式细胞术检测，得出检测结果，所述透膜的荧光染料能够与线粒体膜结合，不透膜的荧光染料可以穿过破损的细胞膜，并与胞内的核酸特异性结合。本发明通过一次检测可同时获得多个参数结果，不仅能够清晰地区分不同状态的精子并显示其比例，得出精子死亡率、存活率、质膜受损率以及具线粒体活性比例，还可以避免主观因素造成的精确率较低的现象，确保检测结果的准确性。

技术领域

本发明涉及一种双壳贝类精子质量检测方法，尤其涉及一种精子受到胁迫之后，检测精子存活率、质膜完整性及线粒体活性的方法及应用。

背景技术

目前，双壳贝类精子质量检测方法均为镜检。将精子置于光学显微镜下，观察精子的运动时间、运动比例及运动的激烈程度。但是，由于每个人的经验和判断标准不同，再加上观察精子存活的时间间隔太长，这类方法往往具有较大的主观性和不准确性，易对实验的精确性造成影响，容易得出错误结论。计算机辅助精子分析系统（CASA）的应用，使精子质量的研究得到较大改善，通过对精子运动轨迹、速度及动态参数的分析，从而鉴定精子的质量。CASA虽然能够对精子密度和活力等参数进行测定，但是其具有一定的局限性，不能检测精子内部结构的变化，尤其是经冷冻保存或者受胁迫的精子，因其质膜完整性和线粒体活性易受到损伤，对精子的质量影响显著。在贝类精子质量的研究中，对精子进行两种荧光染料染色使精子释放不同颜色的荧光，然后在荧光显微镜下随机计数，统计精子的存活率，此类方法虽然能够检测精子内部结构的变化，但是存在较大误差，且费时费力。

因此，现在迫切需要一种精确的精子质量检测方法，既能够提高实验的精确性，又能够方便、快捷、客观地检测精子质量。

发明内容

为了避免传统上镜检精子质量的主观性、不准确性以及不精确性等缺点，本发明提供一种新型的双壳贝类精子质量检测的方法。

PI是一种膜不透性染料，能够进入质膜破损或死亡的细胞内，并释放荧光，常用PI检测细胞质膜的完整性；Rh123是一种阳离子，可以透过质膜与线粒体特异性结合，具有跨膜电位的线粒体能够释放绿色荧光，由于Rh123无毒性，不影响细胞的代谢，所以Rh123常用来检测线粒体活性。故本发明结合Rh123/PI双染与流式细胞术来检测精子质膜受损情况和线粒体活性，并准确测定精子的存活比例，在不损伤精子的情况下，方便快捷地区分各个状态的精子，进而客观准确地评价精子质量。

为达到上述目的，结合上述原理，本发明采取的具体技术方案为：

一种双壳贝类精子质量检测的方法，包括以下步骤：

（1）精液制取：解剖镜检，选择性腺发育好的雄性个体，用吸管吸取精子置于灭菌海水中；

（2）荧光染液配制：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，储存；

（3）精液染色：取一定量精液，加入两种上述荧光染液混合，放置、离心，洗涤，重悬，再进行流式细胞仪检测；

（4）流式细胞仪检测结果：经PI/Rh123染色和FCM检测的精子分布在不同的象限：R1表示质膜破坏线粒体无活性的死精子，R2表示质膜破裂但线粒体仍具有活性，也就是即将死亡的精子，R3表示质膜正常但无线粒体跨膜电位的精子，R4为正常的活精子。

进一步的，所述步骤（1）中，使用血球计数板调整精子浓度为10⁷~10⁸个/mL。

进一步的，所述步骤（2）具体为：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，均配成浓度为1mg/mL的储存液，按照试剂储存要求，分别放于-20℃和-4℃保存。