[发明专利]一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统及应用

权利要求书

1.一种远红光调控的诱导干细胞分化的系统，其特征在于，所述系统包括：远红光调控基因表达环路控制系统和基因定位器；所述远红光调控基因表达环路控制系统能够诱导基因的转录表达；

所述基因包括细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS、c-di-GMP的降解酶YhjH、BldD融合表达的激活子、BldD识别结合的启动子P_FRL1b[(whiG)₂-P_hCMVmin3G]；

所述细菌光敏二鸟苷酸环化酶BphS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述c-di-GMP的降解酶YhjH的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述BldD融合表达的激活子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述BldD识别结合的启动子P_FRL1b[(whiG)₂-P_hCMVmin3G]的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；

所述定位器能够有效靶向到目标基因的启动子位置，包括dCas9蛋白和具有指导靶向作用的所有的单链RNA，激活目标基因表达并诱导干细胞分化；

所述dCas9蛋白可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因位点配对，启动任意外源基因的表达；其中，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述dCas9蛋白可以与由远红光调控基因表达环路控制系统表达的转录激活子相结合，并通过sgRNA与靶基因启动子位点配对，启动体内外任意内源基因的表达。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述体内任意内源基因包括体内肌肉相关的内源基因。

3.一种权利要求1所述远红光调控的诱导干细胞分化的系统的使用方法，具体包括以下步骤：

(1)接种细胞

将生长状态良好的iPSCs细胞接种于24孔培养板中；所述培养板中的培养基为含有15％的胎牛血清、1％的非必需氨基酸的GMEM培养基；所述培养基中还包括浓度为10^-3M的谷氨酰胺、浓度为10^-3M的β-巯基乙醇、活力为1000U/mL的重组小鼠白血病抑制因子，所述培养基需每天更换；

(2)稳转株生产

将远红光调控基因表达环路控制系统，Sleeping Beauty转座酶表达载体电转所述的iPSCs细胞；随后，将所述的iPSCs细胞接种于24孔培养板中，用嘌呤霉素和抗菌素筛选出稳定表达远红光调控基因表达环路控制系统的iPSCs细胞；

(3)病毒感染

将含有dCas9的慢病毒以及靶向分化成神经元的相关内源基因NEUROG2的sgRNA，pWS74：LTR-P_U6-sgRNA1(NEUROG2)-LTR和pWS76：LTR-P_U6-sgRNA2(NEUROG2)-LTR感染所述的稳定表达远红光调控基因表达环路控制系统的iPSCs细胞，每天更换无LIF的GMEM培养基，并在远红光照射6h/d；

(4)诱导分化。

4.一种构建权利要求1所述远红光调控的诱导干细胞分化的系统的方法，具体包括以下步骤：

(1)构建远红光调控基因表达环路控制系统；

(2)构建基因定位器。

5.如权利要求1所述的远红光调控的诱导干细胞分化的系统在调控干细胞分化中的应用。

6.一种制备含有如权利要求1所述的远红光调控的诱导干细胞分化的系统的真核表达载体、工程化细胞或工程化细胞移植载体的方法。