[发明专利]一种抑制梨果锈形成的方法

权利要求书

1.一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，通过抑制梨果皮木质素合成基因表达以抑制梨果锈形成。

2.根据权利要求1所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，设计针对木质素合成基因CAD6基因的互补链，用350µM的互补链溶液喷洒果面，在自然条件下完成果实发育。

3.根据权利要求1所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，具体步骤为：

1）互补链的设计：通过梨全基因组测序，筛选关键基因，获得CAD6序列片段，再通过IPCR反向扩增CAD6的全长；将CAD6 mRNA全序列输入RNAdraw软件，选择计算结构，设置相关参数，按自由能最低原理产生模拟的二级结构；利用Sfold软件进行CAD6mRNA靶序列核酸单链的概率分析；根据靶mRNA的一级结构与模拟的二级结构，选择二级结构中可能形成单链的部位作为靶位点，设计若干长为16-18nt的CAD6 ODNs，若干CAD6 ODNs分别靶向CAD6mRNA的不同区域；用Sfold软件计算出CAD6 mRNA全序列未配对碱基的概率，结合概率筛选出单链概率较高的序列作为CAD6 ODNs的靶序列，将两种方法选出的CAD6 ODNs进行比对，从中选择共同的序列作为最终设计的互补链，最终设计的互补链为CAD6-ODN3序列：5′-TCGGTACCTAACGTCGTT -3′，以硫代磷酸酯修饰合成；

2）互补链溶液配置：配置浓度为350μM的 CAD6-ODN3的水溶液；

3）果实选择：在梨树盛花期后15 d，在同一棵树树冠的向阳面选择长势一致的果实，设置10个处理，10个对照，10个处理组成实验组，10个对照组成对照组；

4）果实处理：以互补链溶液处理实验组的梨果皮，对照组保证在自然条件下发育；对实验组于开花 15 d 后开始在自然条件下用350μM CAD6-ODN3水溶液对果面进行喷洒，需均匀喷洒；果实发育前期，每 4 d喷洒互补链溶液1次，果实发育前期指开花后 15 ~ 67 d；果实发育中期，每 7 d喷洒互补链溶液1次，果实发育中期指开花后 67 ~ 88 d；果实发育后期每 14 d 喷洒互补链溶液1次，直至果实成熟，果实发育后期指开花后 88 d 以后；

5）采样观察：在果实成熟时于田间摘取的梨果实，经肉眼观测果锈发生情况，用果锈覆盖率表示果锈发生程度。

4.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，果锈覆盖率即果锈面积占果实表面积的百分率。

5.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，还包括木质素含量测定的步骤：取等量对照组和实验组梨果皮干粉5.0 mg，置于10 mL试管中，加入0.5 mL 25%溴乙酰-乙酸溶液和0.02 mL高氯酸，密封后于70 ℃恒温水浴锅中水浴30 min；然后，将反应液移入含1 mL 2 mol / L NaOH和2.5 mL冰乙酸混合液的容量瓶中，充分振荡混匀后，用冰乙酸定容5至10 mL；以冰乙酸为空白溶液，在紫外分光光度计的280 nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算木质素含量；取三次生物学重复平均值，以此得到木质素的含量。

6.根据权利要求3所述的一种抑制梨果锈形成的方法，其特征在于，还包括RT-PCR检测的步骤：取等量的对照组和实验组的成熟梨果实的果皮分别提取cDNA，再分别以转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR；荧光定量PCR的引物为：CDA6正向引物：5′-CGAAAGTTGGGAGCAACGTG-3′；CDA6反向引物：5′- CCGTAGGTGATACTGCCGTC-3′。