[发明专利]一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用

说明书

本发明公开了一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。本发明提供了一种抑制登革病毒的CRISPR‑Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA，或二者形成的复合体；所述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列第4657‑4685位。本发明发现一种新的抗登革病毒方法，不同于传统抗病毒方法，直接靶向病毒核酸，特异性降解靶基因，使病毒失去复制能力。因此，具有效率高、特异性强、可编程特点，不易产生传统抗病毒药物所产生的耐药性，未来可能成为一种新的抗病毒药物。

技术领域

本发明属于基因突变和基因工程技术领域,涉及一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用。

背景技术

随着全球变暖和人群流动性日益增多，登革热日益成为重要的热带和亚热带地区的重要传染病，登革病毒是登革热的病原，分为四个血清型,分别命名为DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4。每年大约有5千万到1亿人感染登革病毒，其中大约有1％的感染者发展为重症患者需要住院治疗，表现为登革出血热和登革休克综合征，甚至死亡，目前由于抗体依赖的病毒感染增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)导致登革病毒疫苗的研发困难，也无特异性的治疗药物，临床治疗主要以支持疗法为主，因此，研发针对登革病毒的特异性治疗药物，探索新的抗病毒方法和技术是目前登革病毒研究的重要方向。其中筛选有效的抗登革病毒靶点是研发新的抗登革病毒药物和技术的关键。

登革病毒属于黄热病毒，为单正链RNA病毒，其基因组全长约为11kb，由5’UTR，一个长的开放阅读框和3’UTR。开放读框依次编码3个重要的结构蛋白(Capsid，PrM和Envelope)和7个非结构蛋白(NS1，NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中非结构蛋白在病毒的复制和组装等过程中发挥至关重要的作用。目前的研究策略以针对NS3和NS5的酶活性及其结构，设计不同的模拟化合物抑制剂，从而抑制病毒复制；或者通过抑制病毒包膜蛋白与宿主细胞膜融合设计肽抑制剂抑制病毒复制；或者通过siRNA技术靶向病毒的RNA从而抑制病毒的复制。但是筛选和研发新的抗登革病毒技术仍是登革病毒的重要问题。

近年来，CRISPR技术发展迅猛，基于CRISPR研发的CRISPR-Cas9技术已经被证明是高效、广泛适用的基因组编辑技术，其迅速推广应用正在改变生物学和医学的研究面貌。CRISPR技术的新一轮革命为群雄逐鹿新生物学时代提供了新的利器，同时该技术也已被应用到军事医学基础和应用研究的各个方面，全方位地提升了军事医学研究的原创水平。在抗病毒领域，研究人员已成功利用CRISPR-Cas9技术实现了对HPV、HBV等DNA病毒实现了精确靶向和高效抑制，然而CRISPR-Cas9系统仅能实现对DNA的编辑以及DNA病毒的靶向清除，目前还不能对RNA病毒实现直接地靶向清除。2017年10月，科研人员证实了此前能够非特异切割RNA的CRISPR-Cas13a系统能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA表达水平，同时能够抑制水稻内源性基因的表达。可以预见，新发现的CRISPR-Cas13a技术将在靶向清除RNA病毒以及生物安全防控领域具有不可估量的应用前景，该技术或将为成为一种精准靶向、安全有效的抗病毒治疗方式。

发明内容

本发明一个目的是提供一种抑制登革病毒的CRISPR-Cas13a系统。

本发明提供的CRISPR-Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和登革病毒的NS3基因靶点对应的crRNA，或二者形成的复合体；

所述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列第4657-4685位。

上述登革病毒的NS3基因靶点为登革病毒的NS3基因核苷酸序列GenBank ID：U87411第4657-4685位。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述登革病毒的NS3基因靶点为序列1。