[发明专利]一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用

权利要求书

1.一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于，步骤为：

（1）活性污泥中EPS的提取

a. 量取30-40ml MLSS约5000的泥水混合液置于50mL 的离心管，6000-8000 r/min离心15-30 min，弃去上清液，补充磷酸缓冲液至原液位，混合均匀后得污泥样品；

b. 将得到的污泥样品混入阳离子交换树脂得污泥样品混合液，污泥样品混合液移至混凝土搅拌器，搅拌后取上清进行离心，离心后再取上清经0.45-0.55 μm玻璃纤维滤膜过滤后，得到蛋白质/DNA比值最低的活性污泥EPS溶液；

（2）活性污泥EPS溶液中蛋白质的提取

a. 取活性污泥EPS溶液装入20ka渗析袋，将渗析袋浸泡于丙二醇溶中4-5 ℃下过夜浓缩至1-1.5 mL，将浓缩液转移至离心管内，离心后取上清液转移至新的离心管中，获得胞外EPS浓缩液；

b. 将EPS浓缩液低温下加入100%三氯乙酸溶液，使得最终浓度为10-15%，4-6 ℃静置2-4 h，10000-13000 g离心10-15 min后，弃去上清液，并以冰乙醇洗去残留的三氯乙酸，10000-13000 g离心10-15min后弃去上清液，并重复此步骤2次，置于冷冻干燥机中冻干残余乙醇，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，95-100℃水浴10-20 min，使蛋白质变性，将其搁于-20℃冰箱内保存，即得活性污泥中蛋白质的混合液；

（3）活性污泥胞外蛋白质的分离

活性污泥中蛋白质的混合液通过SDS-PAGE凝胶电泳分离即完成活性污泥胞外蛋白质的提取分离。

2.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中阳离子交换树脂为洁净001×7型阳离子交换树脂。

3.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中污泥样品混合液的配制，根据响应面优化数据设计混合物与阳离子交换树脂的比例，每gVSS污泥样品混合液混合85-90 g阳离子交换树脂。

4.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中搅拌后取上清进行离心的具体操作为，400-450 r/min搅拌1-2 h后，取上清液6000-8000r/min离心20-35 min再取上清液。

5.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（2）a中离心的操作为，10000-11000 r/min离心5-8 min。

6.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（3）中SDS-PAGE凝胶电泳中用到的分离胶浓度为6-12%wt，浓缩胶浓度为4%wt，采用0.8-1%wt 的琼脂糖溶液封住胶条表面，上样量为20μL，100V恒压电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为2-3h；电泳结束后，卸下胶片进行固定、水洗、染色、脱色及观察步骤。

7.如权利要求1-6任一项所述的有效的活性污泥胞外蛋白质，其特征在于：所述活性污泥胞外蛋白质用于揭示污泥的酸性、衰减以及沉降性能的差异。