[发明专利]一种用于去除抗体蛋白中内毒素的方法

说明书

本发明提供一种用于去除抗体蛋白内毒素的方法，是将待处理蛋白样品进行一步亲和层析，步骤如下：(1)用平衡液润洗亲和层析柱、消毒、再平衡、上样；所述平衡液是含有NaCl的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2～7.4，电导率为16.0～18.0mS/cm；(2)用冲洗液冲洗层析柱，用平衡液冲洗层析柱；所述冲洗液是添加了Arg的平衡液；(3)用洗脱液洗脱，收集洗脱液；所述的洗脱液是醋酸钠缓冲溶液，其pH为3.3～3.5，电导率为0.24～0.44mS/cm。本发明可以在不改变抗体蛋白性质的条件下，有效的去除蛋白样品中的内毒素，并且过程中不影响蛋白的纯度，回收率高。本发明处理方法简单，成本低廉，耗时短，采用本方法处理后的样品内毒素含量小于0.1EU/mg，安全性好，临床应用前景良好。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及单克隆抗体内毒素去除方法。

背景技术

内毒素是来自于革兰氏阴性菌外膜的一种脂多糖，由菌体裂解后释放，又被称为“热源”。他们的相对分子质量一般在1～2.5万，在水溶液中形成缔合物，分子质量可以达到50～100万。其化学成分主要为磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成份主要为类脂质A。

内毒素不是蛋白，因此非常耐热，还具有体积小、化学稳定性强等特性，去除有一定难度。只有在160℃温度下加热2～4h，或者240温度下加热1h，也可以用强酸、强碱或者强氧化剂加热煮沸30min才可以破坏它的生物活性。少量内毒素便可引起机体发热，严重时可能引起播散性血管内凝血、休克、发热及炎症反应。

单克隆抗体作为生物大分子药物，培养和纯化工艺复杂，有诸多的环节可能会引入内毒素，因此去除样品中的内毒素，保证其安全性显得尤为重要。国家药典中对注射品中内毒素含量规定应小于1EU/mL。各国药监部门对生物制品内毒素的含量也有着严格的要求。

目前，对于内毒素的去除方法主要有：相分离法，超滤，活性炭吸附法，化学降解法，层析色谱法等。相分离法处理量小，中间还有温度的变化，对一些不稳定的蛋白不利；超滤法用于去除内毒素时，需要根据处理样品的相对分子量及特性选择超滤膜的材质及孔径，不具备通用性；活性炭法在吸附内毒素的同时往往会吸附一些有效成分，对产品的回收率影响较大；化学降解法通过使用强酸强碱强氧化剂来对内毒素进行降解，这受到样品的理化性质的限制；层析法包括离子作用、疏水作用、凝胶作用层析，不同的样品自身的性质不同，层析作用也就不同，筛选耗时耗力。

因此，实现抗体蛋白中内毒素的高效去除将具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供一种去除内毒素的方法，以解决现有内毒素去除方法筛选难的问题。

本发明解决的另一技术问题是提供一种不影响抗体蛋白性质的内毒素去除方法。

本发明的再一技术问题是提供一种明显降低蛋白内毒素去除的时间和成本问题，提高效率。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种用于去除抗体蛋白中内毒素的方法，取待处理生物样品经过一步亲和层析即可，具体步骤如下：

一种用于去除抗体蛋白内毒素的方法，其特征在于：对待处理蛋白样品进行一步亲和层析，步骤如下：

(1)用平衡液润洗亲和层析柱、消毒、再平衡、上样；所述平衡液是含有NaCl的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2～7.4，电导率为16.0～18.0mS/cm；

(2)用冲洗液冲洗层析柱，用平衡液冲洗层析柱；所述冲洗液是添加了Arg的平衡液；

(3)用洗脱液洗脱，收集洗脱液；所述的洗脱液是醋酸钠缓冲溶液，其pH为3.3～3.5，电导率为0.24～0.44mS/cm。

步骤(1)中，所述亲和层析柱使用的填料是MabSelect SuRe。