[发明专利]一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本circRNA高通量测序文库的构建方法，具体包括以下步骤：(1)从石蜡切片中提取总RNA；(2)将样本RNA加上一段PolyA尾；(3)Oligo dT磁珠捕获分离线性RNA；(4)进一步去除残留的线性RNA；(5)构建circRNA高通量测序文库。本发明针对FFPE样本RNA有损伤、含量低、完整性差的特点，提供的一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法操作简单、耗时短、成本低，且能稳定获得满足高通量测序要求的文库，避免了传统文库构建方法中样本需求量大、去除rRNA成本高、效率低等问题。

技术领域

本发明涉及一种高通量测序文库的构建方法，属于生物技术及分子生物学领域，特别涉及一种福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本circRNA高通量测序文库的构建方法。

背景技术

近年来，癌症的发病率明显增多，严重威胁人类健康，肿瘤的研究也成为了全球热点。尽管肿瘤的研究方法和研究角度不断的更新，但人体肿瘤组织标本仍是肿瘤研究不可或缺的重要对象。福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)是病理科普遍采用的组织处理和保存方法。FFPE组织样本制备简单、造价低廉且易于存放，在世界各地的医院及组织样品库中广泛保存，是用于疾病诊断和科学研究的最为常见的生物学资源之一。随着新一代测序技术(NGS)的快速发展，在细胞分子水平提供了前所未有的检测能力，也为肿瘤的个性化治疗提供可能性。研究人员可以使用这一技术手段，重新研究肿瘤FFPE样本，寻找疾病与基因的关系。

CircRNA是一类具有环形闭合结构的RNA，广泛存在于真核生物转录组中。与传统的线性RNA不同，circRNA对核酸酶不敏感，比线性RNA更为稳定，这使其在作为新型临床诊断标记物的开发应用上更具优势。研究表明，circRNA参与癌症等多种疾病的调控，已经成为近年来的研究热点。然而，在FFPE组织标本的制备和贮存过程中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起RNA的交联和降解，科研人员很难获得足量高质量的RNA样本。这使得利用丰富的FFPE组织样本筛选潜在circRNA肿瘤标志物的研究成为困难。

目前，传统circRNA高通量测序文库的构建方法是去除样品中的rRNA后用RNase R去除线性RNA，从而富集circRNA。这种方法对RNA样品的质量要求较高，适用于浓度高，总量多，完整性好的样品。虽然RNase R能消化大部分的线性RNA，但效果并不是很理想，在专利CN 106801050 A公开的发明方法中有效数据circular junction reads仅0.07％左右，FFPE组织等低质量样本更低。而专利CN 104388548 A公开了一种高通量环状RNA测序方法，采用生物素标记后用链霉亲和素磁珠除去线性RNA，使得环状RNA的有效测序数据量提高了14倍。该方法步骤繁琐复杂，且需要预先人工合成外源线性RNA及外源环状RNA，亦不适用于如FFPE组织一类低质量样本。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法。该方法适用于浓度低、含量少、完整性差的RNA样品，且操作步骤简单。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)从石蜡切片中提取总RNA；

(2)将样本RNA加上一段PolyA尾；

(3)Oligo dT磁珠捕获分离线性RNA；

(4)进一步去除残留的线性RNA；

(5)构建circRNA高通量测序文库。

该方法适用于来源于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片样品。