[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用

说明书

本发明提供一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株及其应用，本发明采用基因工程的方法通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的ccpN基因构建得到了地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN，该菌株与地衣芽孢杆菌DW2相比，其杆菌肽产量提高了16%以上。

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。

背景技术

杆菌肽是由枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌产生的一种环肽类抗生素。杆菌肽作为一种广谱性抗生素，能有效的抑制革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌。并且，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，且排泄迅速、没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、异亮组氨酸(His)、D-天冬氨酸(D-Asp)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、D-谷氨酸(D-Glu)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。

转录抑制因子CcpN在菌体的碳代谢中具有重要作用，但目前关于转录抑制因子CcpN的调控机理的研究鲜有报道。现有技术中也没有转录抑制因子CcpN与杆菌肽合成之间关联性的相关报道，因此，转录抑制因子CcpN是否会影响杆菌肽的产量不可预知。

虽然现有技术(《过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的代谢工程》，娄凯，天津大学博士学位论文，2002年07月01日)中有公布“通过敲除枯草芽孢杆菌中的ccpN基因(即转录抑制因子CcpN的基因)构建的枯草芽孢杆菌能够过量合成核黄素”，但是，杆菌肽与核黄素属于完全不同的两种产物，杆菌肽为以初级代谢中产生的各种相应氨基酸为前提物质经非核糖体肤合成途径合成的次级代谢产物，而核黄素为以葡萄糖作为前提物质经磷酸戊糖途径合成的一类碳代谢化合物。因此，该现有技术也并未给出“转录抑制因子CcpN与杆菌肽合成之间关联性”的技术启示，转录抑制因子CcpN是否会影响杆菌肽的产量仍然是不可预知的。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的方法，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。

通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

(2)采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和SacI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori-ccpN；

(5)将ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori-ccpN转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpN基因的上游臂或ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；