[发明专利]一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种反义肽核酸‑DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用。该载体复合物包括能抑制MRSA生长的反义肽核酸和DNA四面体，所述反义肽核酸和DNA四面体的摩尔比为1:1。本发明将DNA四面体与反义肽核酸进行结合，在保留其两者原有优良性质的基础上，其结合形成了一种新型的穿膜载体，解决了目前反义肽核酸在应用中面临的未经修饰的反义肽核酸影响其细胞摄取率的问题；同时该复合物具体新的细胞靶位，与传统抗菌药物具有完全不同的抗菌机制，高度耐药菌MRSA能成功的摄取本发明复合物，并且该复合物能有效抑制MRSA的生长；此外，本发明制得的复合物无细胞特异性，也没有毒性。

技术领域

本发明属于载药体系技术领域，具体涉及一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用。

背景技术

DNA四面体(TDNs)是一种性能优异的纳米材料，无毒性、有良好的生物相容性和生物可降解性，优异的细胞膜通透性，特别是具有精准的结构可控性使其具备强大的应用潜力。当前，在生物医学领域引起广泛的重视，特别是作为一种性质优良的载体。TDNs是由四条特别设计过的无义序列的单链DNA(ssDNA)S1、S2、S3、S4通过自组装形成的具有三维结构的DNA纳米材料，四条单链序列遵循“碱基互补配对原则”，合成方法简单，产率高。目前已发现单纯的TDNs结构能够穿过细胞膜而进入活细胞，并具有促进干细胞增殖，维持细胞形态的作用，其可作为一种载体，且无细胞毒性。反义肽核酸是一种人工合成的DNA类似物，可根据碱基互补配对原则特异性的抑制基因的表达。由于其为电中性，且不存在磷酸基团，所以不存在电性相斥的现象，导致与DNA/RNA结合能力更强，不被核酸酶和蛋白酶水解，从而避免了天然DNA和RNA寡核苷酸作为靶向探针可能导致许多脱靶效应的现象。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，该菌株来源于北京朝阳医院，编号为18908的临床实验株，该菌株是临床上常见的毒性较强的细菌，其具有不均一耐药性，以及广谱耐药性，是一种临床上常见的感染病菌。这类菌株所导致的临床感染治疗失败率较高，被称作“超级细菌”。

在目前的研究中，治疗MRSA感染的药物的靶标多是一些常见的细胞因子，如黏附性因子，影响细胞壁合成因子等，采用这类靶标的药物特点是，容易使其产生耐药性，所以需要从新的角度选择药物作用靶点。另外，反义肽核酸(asPNA)作为一种不带电荷的DNA类似物，无法像核酸一样通过内吞作用进入细胞，所以必须借助载体运输。而当前研究中常用的载体为细胞穿膜肽，该类载体在通常在革兰氏阴性菌中穿膜效果好，而在革兰氏阳性菌中效果略差，且存在较强的细胞毒性，会影响正常的动物细胞的生物学行为。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用，该复合物可有效解决现有的载体存在较强的细胞毒性且使用有限的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物，包括能抑制MRSA生长的反义肽核酸和DNA四面体，反义肽核酸和DNA四面体的摩尔比为1:1；其中，DNA四面体四条单链的核苷酸序列见SEQ ID NO:1-4。

进一步地，能抑制MRSA生长的反义肽核酸为ftsz-asPNA，其核苷酸序列见SEQ IDNO:5。

上述反义肽核酸-DNA四面体载体复合物的制备方法，包括以下步骤：将反义肽核酸与DNA四面体的四条单链中的每条单链按相同的摩尔量混合，然后加入TM buffer中，混匀后置于PCR仪内，将温度升到95℃维持10min，再冷却至4℃维持20min，制得。

进一步地，TM buffer的pH值为8.0，由10mM Tris-HCl和50mM MgCl₂组成。