[发明专利]纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法

权利要求书

1.一种纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）发酵分泌表达重组蛋白rPI-T1的毕赤酵母，将包含rPI-T1的毕赤酵母发酵液的上清液上样至装有Capto-MMC层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，并用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到洗脱液I；

其中，所述发酵使用无机盐培养基，所述无机盐培养基以甲醇作为碳源，并且包括以下以g/ml计的组分：1%磷酸、0.8%硫酸钾、0.05%硫酸钙、0.65%硫酸镁、0.18%氢氧化钾、1%酵母浸出粉；

所述步骤（1）的平衡缓冲液为50mM、pH4.0、电导为2.3-2.4ms/cm的醋酸钠-醋酸缓冲液；所述洗脱缓冲液为100mM、pH8.0、电导为4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl缓冲液；

（2）将步骤（1）获得的洗脱液I上样至装有Qhp层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到包含rPI-T1的洗脱液II;

其中，所述步骤（2）的平衡缓冲液为100mM、pH8.0，电导为4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl缓冲液；所述洗脱缓冲液为100mM的Tris-HCl和50mM的NaCl组成的pH8.0、电导为9.0-9.2ms/cm的缓冲液。

2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液为分泌表达rPI-T1的毕赤酵母发酵液经固液分离所获得的上清液。

3.如权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，所述固液分离为碟片式离心机离心或板框式过滤。

4.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液经Capto-MMC层析柱洗脱之前经过微滤。

5.如权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述微滤为经过中空纤维柱的微滤。

6.如权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述中空纤维柱的孔径为0.1μm。

7.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述洗脱液II中rPI-T1的纯度达97%以上。

8.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中的发酵采用流加甲醇的方式。