[发明专利]一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法

说明书

本发明属于木本植物技术领域，公开了一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，称取柠檬叶，液氮速冻并研磨成粉末，加入甲醇溶液，放置4℃冰箱中过夜；加甲醇洗涤残渣，重复操作2次，合并上清夜；将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次；‑80℃冷藏10min后冻干；用pH＝3.0的PBS4ml溶解；用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相；将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相溶解过小柱；水相，冷藏后冻干，直接保存；用5mL流动相溶解，得ZT；在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。

技术领域

本发明属于木本植物技术领域，尤其涉及一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法。

背景技术

高效液相色谱(HPLC)具有高效、高灵敏度的特点，成为植物内源激素较理想的分析方法。当前最常用的提取方法是用80％的冰甲醇来提取，浸提过夜，收集滤液，旋转蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，溶化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样测定。木本植物具有内含物明显高于草本植物，成分复杂、干扰物质多的特点，采用现有提取工艺不但操作复杂，耗时长，而且一次只能检测一种目标物，峰位重迭、过度密挤、双峰、拖尾等问题严重，还费时费工，并且回收率一般低于80％。

综上所述，现有技术存在的问题是：该方法的工艺流程依照当前分析纯化仪器的进步来说是落后的。当前超低温冰箱和冻干机的应用，不仅可以保障样品目标物的稳定性，而且对小分子挥发物具有很好的消除效果。同时缩短了样品提取时间，提高了回收率，比如旋转蒸发虽然是减压但长时间的高温环境会明显破坏激素结构(IAA最明显)从而显著影响样品回收率，如100mL样品旋转蒸发仪蒸发到干即使在理想条件下也要15分钟，而仅仅蒸发到水相2～3分钟就可以实现。

本发明针对木本材料内含物丰富、多糖多酚类、小分子精油类等干扰物质多的特点，以及植物内源激素的化学物理性质，制定了前处理优化方案，省去了盲目的纯化步骤，采用更先进的纯化仪器，精简了操作步骤。配合液相检测条件的调整，实现了更准确、更高效的检测效果。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法。

本发明是这样实现的，一种适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法，所述适用于木本植物内源激素测定的高效提取方法包括：

步骤一，称取柠檬叶0.2g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80％甲醇溶液10ml，放置4℃冰箱中过夜；

步骤二，加80％甲醇5mL洗涤残渣，重复以上操作2次，合并上清夜；过0.45μm滤头；

步骤三，将过滤后的上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，取水相并用纯水洗涤旋转蒸发瓶1次，合计大概6ml；-80℃冷藏10min后冻干，得干粉；用pH＝3.0的PBS 4ml溶解；

步骤四，用4ml的乙酸乙酯10ml离心管萃取3次，留酯相弃水相；

步骤五，将乙酸乙酯相转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至干，用A泵流动相2mL溶解过Pak-ODS-C₁₈小柱，5ml冲洗，得IAA、GA、ABA。取2ml冻存管保存，为分析前样品；

步骤六，水相，-80℃冷藏10min后冻干，后直接保存；

步骤七，用5mL流动相溶解，得ZT。取2ml冻存管保存，为分析前样品；

步骤八，在进行HPLC分析前样品分别过0.22μm的微孔滤膜，作为供试液。

进一步，所述步骤一中柠檬叶0.2g。