[发明专利]弗林蛋白酶敲减和GM-CSF增强的(FANG)癌症疫苗

权利要求书

1.一种表达载体在制备用于在有需要的受试者中预防、治疗和/或缓解癌症症状的药物中的用途，其中所述表达载体包含bishRNA^{弗林蛋白酶}/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包含：

(a)可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA；和

(b)可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码能够与编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域杂交的一个或多个双功能短发夹RNA(bi-shRNA)，由此经由RNA干扰抑制弗林蛋白酶的表达，其中所述bi-shRNA是弗林蛋白酶表达的剪切依赖性和非剪切依赖性抑制剂，所述bi-shRNA杂交并靶向所述弗林蛋白酶mRNA转录物的核酸300-318、731-740、1967-1991、2425-2444、2827-2851或2834-2852。

2.权利要求1的用途，其中由所述bi-shRNA靶向的区域为所述弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR。

3.权利要求1的用途，其中由所述bi-shRNA靶向的区域为所述弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区。

4.权利要求1的用途，其中所述弗林蛋白酶mRNA转录物为NCBI参考序列登录号NM_002569。

5.权利要求1的用途，其中所述第二核酸插入物编码ggauccugcu guugacagugagcgcggaga aaggagugaa accuuaguga agccacagau guaagguuuc acuccuuucu ccuugccuacugccucggag uccugcuguu gacagugagc gcggagaaag auaugaaacc uuagugaagc cacagauguaagguuucacu ccuuucuccu ugccuacugc cucggaagcu uug(SEQ ID NO:1)的RNA序列。

6.权利要求1的用途，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)哺乳动物启动子。

7.权利要求6的用途，其中所述表达载体进一步包括CMV IE 5’-UTR增强子序列和CMVIE内含子A序列。

8.权利要求1的用途，其中所述表达载体进一步在所述第一和第二核酸插入物之间包括编码小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽的核酸序列。

9.权利要求1的用途，其中所述GM-CSF cDNA是人GM-CSF cDNA。

10.权利要求1的用途，其中所述癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、胆囊癌、肺癌或黑色素瘤。

11.权利要求10的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)或鳞状细胞癌。

12.一种制备弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子(GM-CSF)增强(FANG)的癌症疫苗组合物的方法，其包括：

(a)将来自具有癌症的受试者的肿瘤细胞置于无菌容器中的抗生素溶液中；和

(b)由所述溶液形成细胞悬液，其中所述细胞悬液的形成通过酶分解、机械解聚或两者实现；

(c)使用表达载体转染所述细胞悬液以生成所述FANG疫苗，其中所述表达载体包含bishRNA^{弗林蛋白酶}/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包含：

(a)可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA；和

(b)可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码能够与编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域杂交的一个或多个双功能短发夹RNA(bi-shRNA)，由此经由RNA干扰抑制弗林蛋白酶的表达，其中所述bi-shRNA是弗林蛋白酶表达的剪切依赖性和非剪切依赖性抑制剂，所述bi-shRNA杂交并靶向所述弗林蛋白酶mRNA转录物的核酸300-318、731-740、1967-1991、2425-2444、2827-2851或2834-2852；

(d)收获该疫苗；

(e)辐照该疫苗；和

(f)冷冻该疫苗。