[发明专利]重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶

说明书

本发明公开了重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，主要通过复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料，利用三者之间的化学反应交联形成，相比较从动物中提取的天然胶原蛋白，重组胶原蛋白具有低抗原性，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性，本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的引入，所用的原料均无生物学毒性，因此所制备的凝胶具有良好的生物相容性，同时该种凝胶还具备良好的生物降解特性，具有诱导成骨的作用，可促进骨缺损的修复。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程，医用生物材料制备技术领域，具体为重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶。

背景技术

水凝胶具有良好的生物相容性及生物可降解性，具备类细胞外基质的仿生特性及三维水化网状结构，有利于细胞的迁移和生长，因此是移植细胞或缓释生长因子的适宜载体。因此将水凝胶体系作为一种组织工程骨缺损修复材料具有重要应用前景。

胶原蛋白是动物体中含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，广泛分布于动物体的各种组织中，占哺乳动物体内蛋白质的25％～30％，相当于体重的6％。对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。胶原蛋白的侧链上含有羟基，羧基，氨基等多种活性基团，易于参与反应制备各种不同的生物材料。由于胶原蛋白具有优良的生物相容性和低抗原性，其在生物以及医学等领域也有着广泛的应用，根据不同的用途，胶原蛋白被制成人工皮肤，人工血管，人工尿道，人工心脏瓣膜，植入人工牙，止血粉剂，手术缝合线，组织工程支架材料，人工软骨，药物载体等。

由于天然胶原蛋白往往带有很多免疫反应位点，会引起生物体的免疫反应，而且天然胶原蛋白在提取过程中会用到强酸强碱等化学药品，最终提取所得到的往往是各种长度和分子量的多肽，不是单一组成的产品，导致其在生物医学应用上收到很大的限制。通过基因工程方法用大肠杆菌所培养出来的重组胶原蛋白，无免疫位点，具有-G-X-Y-周期性序列，胶原蛋白特有的三螺旋结构，良好的生物相容性、以及生物降解性。自动物体提取的胶原蛋白，存在水溶性不佳，可加工性弱，质量不稳定等缺陷。而且,动物来源的胶原蛋白难以排除疯牛病，口蹄疫等病毒风险。重组胶原蛋白没有这些问题

发明内容

本发明的目的在于提供重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和壳聚糖的骨修复凝胶,主要包括复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及壳聚糖三种材料。

优选的，其制备方法包括以下步骤：

A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白，包括以下步骤：

a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：

(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；

(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中在37℃环境中继续扩大培养；

(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6～0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃-25℃继续培养8h-10h诱导蛋白表达。将菌液离心，收集细胞沉淀；

c、重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：

(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，其中缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；