[发明专利]一种植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法

说明书

本发明涉及植物生物技术领域，具体是一种改良的植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法，直接微量取样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选。本发明优点在于：本发明的方法，不需要烘干过程，采用液氮速冻后研磨粉碎，大大节约了样品处理时间；本发明建立了一套优化的微量离心管处理样品、酶标板测定的微量测定体系，大大节省了蒽酮、浓硫酸等化学试剂的用量，该方法可以配合移液工作站使用，实现高通量检测方法；本发明建立了一套基于植物新鲜组织微量样品的测定方法，为植物活体叶片中可溶性糖含量的时空分布规律研究提供了简便有效的评估手段，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有用线索。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，是一种改良的植物鲜叶可溶性糖快速微量测定方法。

背景技术

糖是植物体内一类重要有机物，对植物生长发育与形态建成具有重要作用。糖不仅作为呼吸底物为植物的生长发育提供能量，而且还作为代谢中间产物合成植物细胞结构物质的碳架等。同时糖还植物体内重要的信号分子，对基因的表达也起到调控作用。可溶性糖指易溶于水的糖，常见的如葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，与植物的抗逆性(如抗旱性、抗寒性等)密切相关。同时，可溶性糖还影响到植物食用组织或器官的品质与口感。因此，植物组织中可溶性糖含量测定是一项常规测定指标，建立快速准确的检测方法对于科研和生产具有重要意义。

蒽酮硫酸比色法是测定植物组织可溶性糖含量的常用方法，其原理是糖在浓硫酸作用下，脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应，生成蓝绿色化合物，在一定的范围内，颜色深浅与糖的含量成正比。蒽酮法测定可溶性糖因其准确性高、重现性好、操作简便、快速、灵敏等优点而被广泛应用于各种植物组织中可溶性糖含量的测定。尽管一些文献报道对蒽酮比色法测定可溶性糖的方法进行了优化(参考文献：丁雪梅,张晓君,赵云,等.蒽酮比色法测定可溶性糖含量的试验方法改进[J].黑龙江畜牧兽医,2014(23):230-233；位杰,吴翠云,蒋媛,等.蒽酮法测定红枣可溶性糖含量条件的优化[J].食品科学,2014,35(24):136-140；)，但在实际应用中仍然存在一些需要改进之处，如样品需要烘干测定，粉碎和提取反应时间较长，反应试剂用量较多，采用常规比色皿测定需要样品体积较多、一次测定样品数目非常有限等问题，急需建立一种针对植物鲜叶的，优化样品处理流程，快速微量测定植物中的可溶性糖含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种针对植物新鲜叶片，直接微量取样，简单提取后采用酶标板快速测定方法，适合于针对大批量材料采用高通量的筛选。

本发明的第一方面，提供一种快速微量测定植物新鲜叶片中可溶性糖含量的方法，包括以下步骤：

A)取植物新鲜叶片10-100mg，装入离心管中；

B)向离心管中加入少许液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；

C)待液氮挥干，加入1.0ml超纯水，混匀；

D)放入沸水浴(100℃)加热10min；

E)取出离心管，10000rpm离心3min；

F)吸取上清溶液50μl到另一离心管中；

G)依次加入450μl超纯水，蒽酮(20mg/ml)100μl和浓硫酸(1.84g/cm³)1000μl，混匀；

H)放入沸水浴(100℃)加热；

I)取出离心管，冷却10min；

J)取显色液采用酶标仪，在620nm波长下测定其吸光度(A)；

K)取葡萄糖标准溶液，采用步骤G-J，进行显色反应，测定吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，以糖含量C为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程和相关系数R；