[发明专利]人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法

说明书

本发明涉及人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。在α‑MEM基础培养基中添加内皮素3,地塞米松，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白和胎牛血清。方法是将人羊膜制成人羊膜上皮干细胞悬液；将细胞置于添加内皮素3,地塞米松，干细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白和胎牛血清的α‑MEM培养基中；在37℃，5%CO₂培养箱中培养成羊膜上皮干细胞贴壁单层，逐渐诱导分化成表达黑色素细胞标记基因酪氨酸酶相关蛋白l（trp1），2（trp2）、小眼畸形相关转录因子（mitf）、酪氨酸酶（dtc）阳性的黑色素细胞。具有细胞来源丰富、免疫原性低，不受伦理限制，诱导方法简便的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域的一种上皮干细胞分化为黑色素细胞培养基及其方法，具体涉及的是人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。

背景技术

皮肤色素沉着对人类的健康和皮肤美观起着至关重要的作用，尤其是面部等暴露部位皮肤更为重要。由于黑色素细胞合成的色素可以保护机体免受环境的攻击和各种危险细胞的侵袭，所以皮肤色素的缺失不仅可以导致白癜风等免疫性疾病，而且影响患者的心理健康。

白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病。由于皮肤的黑色素细胞功能消失引起，全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。但机制还不清楚。除药物治疗、脱色疗法、物理疗法、对皮损稳定无进展的患者可行自体表皮移植手术外，还有一项发明专利将自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法(专利号CN201710169785.9)等自体黑色素细胞移植治疗方法。不仅脂肪间充质干细胞来源于中胚层，且由于取患者自体正常皮肤进行诱导黑色素细胞时，取材形成创面局部宜形成新的白癜风。人羊膜上皮干细胞和黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，更易分化为黑色素细胞。因此，异体黑色素细胞移植治疗已成为最优选的治疗方案之一。

干细胞是未分化细胞且具有多向分化潜能，可以分化形成各种特定类型的目标细胞。在众多的干细胞中，人羊膜上皮干细胞不仅与黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，而且具有免疫源性低、取材方便等优点，必将成为异体黑色素细胞移植治疗白癜风的优先选择目标细胞。

发明内容

本发明针对现有白癜风治疗方法的自体黑色素细胞来源困难及异体黑色素细胞来源免疫源性限制等问题，而提供同种异体来源广泛，无或低免疫源性问题的一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。

本发明技术方案如下：

人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：

人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，包括如下步骤：

(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备

采用机械法剥离羊膜组织，用生理盐水反复冲洗，除尽表面血迹，取人羊膜5×5cm²，剪碎，置于15×15cm²平皿中，加入0.25克/升胰蛋白酶，37℃消化20-35分钟后，用10-20％胎牛血清中止消化，收集上清液，再用同样方法消化7-12分钟后中止消化，将上述2次收集上清液混合，过200目细胞筛后，将滤液在800-1200转/分钟条件下，离心8-12分钟，弃上清，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；

(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增

将第(1)步所得到细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养，并通过换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；

在上述第(2)步中，将第(1)步所得到细胞以2×10⁶L^-1-2×10⁷L^-1密度接种于培养基中培养；