[发明专利]同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法

说明书

本发明属于植物内源激素分析技术领域，公开了一种同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法，用于检测干扰物质较多、较复杂的木本植物材料柠檬叶片内源激素的高效检测方法；包括：内源激素的快速纯化提取；固相萃取洗脱；三种内源激素的同步分析测定。本发明利用了检测方法的分离特点实现了提取方法与检测方法的结合，有效消除了干扰物质对目标峰的影响获得了清晰的、易识别的分析图谱，同时具有耗材少、回收率高等优点，适用于干扰物质多、较难定量测定的植物组织材料三种内源激素的快速准确检测。

技术领域

本发明属于植物内源激素分析技术领域，尤其涉及一种同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法。

背景技术

高效液相色谱(HPLC)具有高效、高灵敏度的特点，成为植物内源激素较理想的分析方法。当前最常用的提取方法是用80％的冰甲醇来提取，浸提过夜，收集滤液，旋转蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，溶化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样测定。木本植物具有内含物明显高于草本植物，成分复杂、干扰物质多的特点，采用现有提取工艺不但操作复杂，耗时长，而且一次只能检测一种目标物，峰位重迭、过度密挤、双峰、拖尾等问题严重，还费时费工，并且回收率一般低于80％。

综上所述，现有技术存在的问题是：该方法的工艺流程依照当前分析纯化仪器的进步来说是落后的。当前超低温冰箱和冻干机的应用，不仅可以保障样品目标物的稳定性，而且对小分子挥发物具有很好的消除效果。同时缩短了样品提取时间，提高了回收率，比如旋转蒸发虽然是减压但长时间的高温环境会明显破坏激素结构(IAA最明显)从而显著影响样品回收率，如100mL样品旋转蒸发仪蒸发到干即使在理想条件下也要15分钟，而仅仅蒸发到水相2～3分钟就可以实现。

本发明针对柠檬材料内含物丰富、多糖类、多酚类、芳香物质、小分子精油类等干扰物质多的特点，制定了前处理优化方案，省去了盲目的纯化步骤，采用更先进的纯化仪器，精简了操作步骤。配合液相检测条件的调整，实现了同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法，并且更准确、更高效的检测效果。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法。

本发明是这样实现的，一种同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法，所述同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法利用检测方法的分离特点实现提取方法与检测方法的结合；包括：内源激素的快速纯化提取；固相萃取洗脱；三种内源激素的同步分析测定。

进一步，所述同步分离柠檬内源激素赤霉素、生长素和脱落酸的方法包括以下步骤：

步骤一，内源激素赤霉素、生长素和脱落酸三类激素的提取；

步骤二，pH值调节，干粉用pH＝3.0的PBS溶解；

步骤三，脱色，等体积石油醚萃取三次，取脂相。加PVPP除酚类，离心取上清。

步骤四，固相萃取洗脱；

步骤五，高效液相色谱分析检测。

进一步，所述步骤一具体包括：

(1)浸提：0.2g柠檬功能叶鲜样，液氮研磨成粉末后加10mL提取液，-20℃提取过夜，得浸提液；提取液为：80％的冰甲醇，外加50mg/mL 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚作抗氧化剂；

(2)离心：4℃15000g、离心10min；

(3)过滤除杂：上清夜过0.45μm滤头。

(4)提取上清夜转入旋转蒸发瓶中，在36℃、弱光下减压蒸发至水相，-40℃冻干，得干粉；

(5)乙酸乙酯溶解，减压蒸干得干粉。