[发明专利]一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法

说明书

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其具体操作步骤包括顺次执行的机械分离绒毛膜组织、胰酶消化、胶原酶Ⅱ消化、细胞过滤、传代纯化、冻存检测等操作步骤。采用该方案来培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低。

技术领域

本发明涉及生物科学领域中的干细胞分离技术，具体涉及一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法。

背景技术

在生物科学领域中，间充质干细胞被认为是一类能够自我更新，具有多向分化能力的干细胞。其最早是在骨髓中发现，后来经证实，在脂肪、骨膜、滑膜、肌肉、牙髓及脐血等多种组织中都存在这种细胞。有研究表明，脐带及胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性，而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力。因此，胎盘来源的间充质干细胞在生物科学领域中具有相当广阔的应用前景。

人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞(human chorionderived mesenchymal stemcells，hCDMSC) 是一类新兴的干细胞来源，因其取材方便，不受伦理学限制等优点，受到了越来越多学者的关注。由于hCDMSC在组织工程、干细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的应用前景，且由于其特殊的生物特性，间充质干细胞在组织工程和自身免疫、移植物抗宿主病等多个方面备受关注，被认为是今后干细胞研究中的热点领域。但是国内暂无有关hCDMSC的报道，国外的报道也很少，因此对hCDMSC的分离技术、生物学特性认识很有限，很大程度上限制了hCDMSC的广泛应用和推广，而相应的分离技术也相对落后，操作复杂、分离困难且培养效果差、产量低，还容易出现产生二次污染。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，采用该方法来培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低，以解决上述技术背景中的缺陷。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，包括以下操作步骤：

1）使用无菌止血钳剥除胎盘的羊膜层并将胎盘蜕膜部分剪下，然后将处理后的胎盘放入培养皿中用生理盐水冲洗，除去较大的血块。

2）将除下的羊膜层剪成2*2cm²大小，并转移到加入青链霉素的生理盐水培养皿中，将其浸泡2min；用止血钳将蜕膜部分的绒毛膜层进行分离，并将分离后的绒毛膜层转移到装有生理盐水的培养皿中备用。

3）将步骤2）中处理好后的绒毛膜层按4~6g每份分开，分别用有齿镊转移到50ml离心管中，并用剪头组织剪将其剪碎，然后用生理盐水定容至40ml，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用。

4）将步骤3）中处理后的组织块加入新的离心管中用胰酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用。

5）将步骤4）中处理后的组织块加入新的离心管中用胶原酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后利用离心分离，弃上清液，然后将分离后的离心管底部的细胞用生理盐水吹打均匀，配平后再次进行离心分离，弃上清液。

6）将经过步骤5）处理的离心管先用3ml加有青链霉素的培养基将离心管底部的细胞团吹散，再加入12ml加有青链霉素的培养基吹打均匀，平均分配到3个T75培养瓶中，再往每个培养瓶中加入培养基至9ml，然后在培养箱中进行培养。

7）将培养箱培养48min后内进行换液，即将原代培养的培养基全部吸出，然后加有青链霉素的培养基，在培养箱中继续培养，之后每隔3天进行一次换液循环。