[发明专利]一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体

说明书

本发明公开了一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过定点突变的方式，将羧甲基纤维素酶分子内部将第21位缬氨酸替换为谷氨酸，将第96位和第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸，显著提高了菌株表达羧甲基纤维素酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，复合突变菌株pET‑22b(+)‑cmc‑V21E/M96K/M135K酶活提高最为显著，153.92 U/mL，较出发菌株提高了1.71倍，突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所提高。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

羧甲基纤维素酶可作为水解酶加入预处理后的木质纤维素材料中，将纤维素酶分解成可发酵的单糖。未来随着生物燃料的商业化生产，酶的需求量将大大增加。然而，现今的商业酶不仅活力低而且价格贵，难以实现工业化应用。所以通过筛选出纤维素酶产量高，具有较高酶活性的纤维素菌株，是降低生物燃料成本的有效手段。现今，大多数的纤维素酶都是从真菌中获得，从真菌中获得的纤维素酶产量高、活性高，并且其作为胞外酶易于分离和提取。

目前报道的多数羧甲基纤维素酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种酶活较高并能高效表达的羧甲基纤维素酶对于工业化生产羧甲基纤维素酶，及运用羧甲基纤维素酶调节生物机体健康状况具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的羧甲基纤维素酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧甲基纤维素酶的氨基酸序列进行定点突变，将第21位缬氨酸替换为谷氨酸，并将第96位和第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸，从而提高羧甲基纤维素酶的活性。

本发明的第二个目的是提供表达所述羧甲基纤维素酶突变体的细胞系。

本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以pET-22b(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达所述突变体。

本发明的第四个目的是提供一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法是将含有编码所述羧甲基纤维素酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是pET-22b(+)为载体、以E.coli BL21(DE3)为宿主表达所述羧甲基纤维素酶突变体。

本发明的第五个目的是提供一种提高羧甲基纤维素酶活力的方法，将第21位缬氨酸替换为谷氨酸，并将第96位和第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸。

本发明的第六个目的是提供一种生产羧甲基纤维素酶的方法，是将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，37℃培养12～30h.

在本发明的一种实施方式中，所述接种量按体积比为1％。

在本发明的一种实施方式中，所述菌体至OD₆₀₀为0.8～1.0时，加入IPTG诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还将诱导培养后的发酵液离心，收集菌体，并破壁纯化获得纯酶。

本发明还提供所述羧甲基纤维素酶突变体在食品、化工领域降解纤维素方面的应用。

有益效果：本发明通过定点突变的方式，显著提高了菌株表达羧甲基纤维素酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，酶活力提高至83.27U/mL～94.32U/mL，复合突变菌株pET-22b(+)-cmc-V21E/M96K/M135K酶活提高最为显著，达到153.92U/mL，较出发菌株提高了1.71倍，突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所提高，适用于碱环境下分解纤维素材料。

具体实施方式

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；