[发明专利]基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器的构建方法及应用

权利要求书

1.一种应用于ALP活性检测及其抑制剂筛选的基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器，其特征在于，所述多功能电化学传感器通过以下方法构建：

步骤(1)，利用腺嘌呤和HAuCl₄水溶液合成腺嘌呤/Au(III)复合物；

步骤(2)，预处理金电极，在piranha溶液中加热3～10分钟以去除任何先前的有机层，用氧化铝浆，得到镜面状的样品，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H₂SO₄水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间5～15分钟，最后，将电极用水洗涤并在氮气流下干燥；所述piranha溶液为30％H₂O₂∶浓H₂SO₄，体积比3∶7；

步骤(3)，通过将预处理的金电极浸入含有0.1～1μM捕获探针的固定缓冲液中6～16小时，然后将含有不同终浓度的ALP、0.1M MgSO₄的总体积为2.5～10μL的Tris-HCl缓冲溶液滴至电极表面，37℃孵育20～60分钟，记为电极1；将dTTP，TdT和TdT缓冲液滴加到电极1表面，实现扩增得到富T DNA长链，标记为电极2；将步骤(1)合成的腺嘌呤/Au(III)复合物溶液滴至电极2上，通过氢键作用和碱基互补配对作用与TdT延长的富T DNA长链进行杂交吸附，获得电极3，即为所述多功能电化学传感器；通过改变ALP的浓度，电化学信号响应发生改变，实现ALP活性的定量检测；

其中，步骤(3)中，所述捕获探针是3’-PO₃末端的DNA；所述不同终浓度的ALP的浓度范围0～240U/L；所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH 9.0。

2.根据权利要求1所述的多功能电化学传感器，其特征是，利用腺嘌呤/Au(III)复合物的电催化活性以及腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链的特异性杂交吸附作用，采用循环伏安法，设置电位范围为-1.0～0V，检测传感器在含有5mM H₂O₂的PBS中测量所得溶液的电化学响应，根据电流响应的大小确定与DNA相关酶ALP活性及其抑制剂的关系；其中，PBS溶液浓度为0.1M，pH 7.4。

3.一种基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器应用于ALP抑制剂评估的方法，其特征是，所述多功能电化学传感器通过以下方法构建：

步骤(1)，利用腺嘌呤和HAuCl₄水溶液合成腺嘌呤/Au(III)复合物；

步骤(2)，预处理金电极，在piranha溶液中加热3～10分钟以去除任何先前的有机层，用氧化铝浆，得到镜面状的样品，用超纯水超声波洗涤，氮气干燥，在0.1M H₂SO₄水溶液中循环伏安扫描，保持电压为-0.3～+1.5V，时间5～15分钟，最后，将电极用水洗涤并在氮气流下干燥；所述piranha溶液为30％H₂O₂∶浓H₂SO₄，体积比3∶7；

步骤(3)，通过将预处理的金电极浸入含有0.1～1μM捕获探针的固定缓冲液中6～16小时，随后将不同终浓度的Na₃VO₄水溶液在37℃下加入到ALP反应溶液中，然后将该反应液滴至电极表面孵育20～60分钟，记为电极1’；将dTTP，TdT和TdT缓冲液滴加到修饰电极表面，实现扩增得到富T DNA长链，标记为电极2’；将步骤(1)合成的腺嘌呤/Au(III)复合物溶液滴至电极2’上，通过氢键作用和碱基互补配对作用与TdT延长的富T DNA长链进行杂交吸附，获得电极3’，即为所述多功能电化学传感器；

通过改变Na₃VO₄水溶液的浓度，电化学信号响应发生改变，实现ALP抑制剂评估；

其中，步骤(3)中，所述捕获探针是3’-PO₃末端的DNA；所述不同终浓度的Na₃VO₄的浓度范围为0～2400μM；所述ALP反应溶液含有10U/L ALP和0.1μM MgSO₄。