[发明专利]基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR‑Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法。本发明首先获得特异性靶向SQSTM1基因第二外显子的sgRNA序列；其次构建SQSTM1基因的sgRNA到慢病毒载体系统，该载体表达Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒载体转染B16F10细胞，药筛后获得SQSTM1的敲除细胞株。转染GFP质粒实验发现，所获得的SQSTM1的B16F10敲除细胞株具有转染效率明显高于未敲除细胞的优势。本发明具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好，且对SQSTM1基因切割效率高；并能明显提高B16F10细胞的转染效率，为基础研究提供更好的细胞工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法。

背景技术

转染是将外源核酸（包含：质粒，siRNA等）导入真核细胞中并发挥其功能的一种技术。目前转染被广泛应用于生物研究当中。然而许多生物学功能研究和涉及基因治疗的多种药物治疗受限于细胞的转染效率。

B16F10细胞是一种小鼠黑色素瘤细胞株，易于培养；目前被用于小鼠体外Cas9gRNA活性验证，但目前该细胞转染效率不高，常用lipo2000脂转效率在10%左右，大大限制了后续gRNA活性验证的检测。

细胞内吞作用是调节细胞摄取质粒DNA的关键过程。重要的是，内吞作用可以促进诱导自噬作为细胞对胞外DNAs进入细胞而产生的防御机制。最近的报告显示，一些转染试剂，如磷酸钙沉淀（CPPs）和脂质体（阳离子脂质），用于基因传递诱导自噬。研究显示耗尽或敲除SQSTM1可以大大提高小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和胚胎干（ES）细胞和人宫颈癌（Hela）细胞的基因传递效率。这些数据提示敲除SQSTM1可能有助于建立新的方法提高哺乳动物细胞基因传递效率。

为了更好的提高难转染的B16F10细胞基因传递效率，本研究采用CRISPR/Cas9系统，通过设计针对SQSTM1基因序列的sgRNA片段，构建慢病毒sgRNA表达载体，从而特异性的靶向敲除SQSTM1基因。

参考文献

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发明内容

本发明的首要目的在于提供一种靶向敲除SQSTM1基因的sgRNA慢病毒载体。

本发明的另一目的在于提供靶向敲除SQSTM1基因的小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞的应用，提高B16F10细胞转染效率。