[发明专利]诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用

权利要求书

1.一种诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：

向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因，其中，所述转录因子包括Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，所述ASF1A-FD基因包括编码ASF1A蛋白的第1号氨基酸～第154号氨基酸的基因；以及

细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述ASF1A-FD基因包括：

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，

(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列，或

(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述向皮肤成纤维细胞中导入转录因子以及ASF1A-FD基因的步骤包括：

将皮肤成纤维细胞培养至汇合度为50％～80％；以及

用逆转录病毒感染所述皮肤成纤维细胞使得所述转录因子以及所述ASF1A-FD基因进入所述皮肤成纤维细胞中，其中，所述逆转录病毒包括携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒。

4.根据权利要求3所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，其特征在于，所述逆转录病毒通过如下方法制备得到：

将gag基因、pol基因和env基因转染人胚肾HEK293细胞，获得病毒包装细胞；以及

将Oct3/4质粒、Sox2质粒、Klf4质粒、c-Myc质粒以及ASF1A-FD质粒分别转染所述病毒包装细胞，并分别培养转染后的所述病毒包装细胞并收集培养上清，获得携带Oct3/4的逆转录病毒、携带Sox2的逆转录病毒、携带Klf4的逆转录病毒、携带c-Myc的逆转录病毒和携带ASF1A-FD基因的逆转录病毒，混匀后得到所述逆转录病毒。

5.根据权利要求1所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，所述细胞培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程获得诱导性多能干细胞的步骤包括：

将层粘连蛋白和含钙镁的磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，并将所述混合液加入培养皿中，在2℃～8℃下放置12h～48h，去除所述混合液，得到混合液包被后的培养皿；

将导入了转录因子以及ASF1A-FD基因后的所述皮肤成纤维细胞加入到包被后的所述培养皿中，继续培养使得所述皮肤成纤维细胞发生重编程出现胚胎干细胞样克隆，得到所述诱导性多能干细胞。

6.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，通过如权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。

7.如权利要求1～5任一项所述的方法或如权利要求6所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。

8.一种体外制备软骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用如权利要求1～5中任一项所述的诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法获得诱导性多能干细胞；以及

将所述诱导性多能干细胞置于成软骨诱导分化培养基中培养使得所述诱导性多能干细胞分化得到所述软骨细胞，所述成软骨诱导分化培养基中含有0.5％v/v～2％v/v的ITS细胞培养添加物、5ng/mL～20ng/mL的TGF-β1、50mmol/L～200mmol/L的地塞米松和0.05mmol/L～0.5mmol/L维生素C-2磷酸钠。