[发明专利]一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT‑mth2‑36p5及其编码基因与应用。本发明的紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT‑mth2‑36p5是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验表明：该蛋白对苜蓿斑蚜有很好的抑制作用，对蚜虫的存活率和繁殖率都有抑制作用，可用于蚜虫的防治。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿胰蛋白酶抑制剂MT-mth2-36p5及其编码基因与应用。

背景技术

数千万年的进化植物体产生了抗食草性动物的机制，如蛋白酶抑制剂的形成，植物源蛋白酶抑制剂是一类抑制蛋白水解酶活性的物质，在调控蛋白酶参与的生理生化活动中起着重要作用。而蛋白酶参与了昆虫的食物消化、病原菌的侵染与扩展等过程，因此植物源蛋白酶抑制剂在抗病抗虫中的应用被广泛开发。

关于蛋白酶抑制剂的抗虫机制，目前还不是很清楚。Hahnenberger等认为抗虫作用可能主要源于抑制剂的存在使消化酶的过度分泌造成必需氨基酸的缺乏而非对蛋白酶的直接利用抑制。蛋白酶抑制剂影响的不仅仅是昆虫肠蛋白酶，它们还影响到昆虫的水分平衡、蜕皮以及体内酶的调节。还有研究表明蛋白酶抑制剂能影响昆虫神经系统、免疫系统和蜕皮过程。蛋白酶抑制剂对害虫的作用效果受其合成、积累、降解和诱导昆虫蛋白酶的合成和调控的影响。

另外还有研究表明将KTI加入昆虫食料中，证实KTI可影响昆虫的消化和发育；澳洲日野黑蟋蟀和迁徙蚱蜢的肠道蛋白酶也受多种胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂的抑制，取食抑制剂后其生长发育也明显受到影响；在血液中加入胰蛋白酶抑制剂后，角蝇的生殖力明显下降；用蛋白酶抑制剂含量为50μg/g组织的烟草叶片作为烟草天蛾的唯一食物时，烟草天蛾幼虫的生长就受到明显的抑制；用蛋白酶抑制剂含量高一倍的烟草叶片饲喂部分烟草天蛾的幼虫就死亡；除此之外，大豆胰蛋白酶抑制剂还对棉铃虫、棉铃象甲、甘蓝夜蛾和豌豆蚜等昆虫的生长发育造成影响。

随着分子生物学的发展，一些表达KTI的基因已经被克隆，KTI抗虫谱广泛，有希望发展出一套取代农药的无公害的抗虫技术。很多学者从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，然后反转录成单链cDNA，以此为模板，用PCR方法扩增出SK-TI基因，并克隆到载体特定位点上，构建了此基因的一系列植物表达载体，用于烟草、水稻、棉花等作物的转化，研究表明这些转基因作物具有明显的抗虫能力。Manus等将KTI基因Tia转入白三叶草，发现白三叶草具有一定的抗虫性；转KTI基因所获得的潮霉素抗性水稻植株，部分转基因水稻植株明显地增强了对水稻二化螟虫的抗虫性。Cordero等的研究结果表明，植物愈伤组织能诱导蛋白酶抑制剂基因的表达，当植物组织受创时，其机体内蛋白酶抑制剂含量急剧上升；Kim等研究发现，马铃薯蛋白酶抑制剂-Ⅱ基因具有损伤诱导型启动子，如果将这类启动子应用于植物基因工程，使其调控其它外源抗虫基因在植物中表达，将体现出重要的应用价值。

苜蓿斑蚜属蚜科、半翅目，是农牧业上重要的刺吸式害虫，主要危害豆科植物苜蓿，由于蚜虫繁殖能力强，发生世代多数多，多年来防治蚜虫危害主要依靠的是化学防治，大量且不合理的化学农药使用导致蚜虫的抗药性不断产生，并且造成了环境污染。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何防治害虫、抑制害虫的生长和发育。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蛋白酶抑制剂，本发明的蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂，来源于紫花苜蓿Medicago sativa.，本发明提供的胰蛋白酶抑制剂的名称为MT-mth2-36p5，所述MT-mth2-36p5蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；