[发明专利]一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法

说明书

本发明是一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法。本方法将制备的细胞悬浮液加入优化后的Fluo‑3 AM，添加0.8mM Pluronic F‑127，获得最大荧光强度F_max值，或添加钙离子螯合剂EGTA，获得最小荧光强度F_min值，制备的细胞悬浮液加入优化后的Fluo‑3 AM经大气压冷等离子体处理，结合多功能酶标仪测定F值，再根据公式计算出绝对钙离子浓度。本发明实现了荧光探针Fluo‑3 AM结合多功能酶标仪测定细胞绝对钙离子浓度的方法，该方法具有灵敏、高效、简便、精确测定和表征细胞内钙离子绝对浓度。

技术领域

本发明属于细胞内钙离子浓度定量检测技术领域，具体是一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法。

背景技术

钙离子作为重要的第二信使，参与细胞内多种信号传导并调控一系列生命活动。细胞内钙离子浓度在一定范围内(1～10μM)，有助于微生物生长和产物形成，但是钙离子浓度过高会抑制菌体生长，甚至促进菌体死亡。大气压冷等离子体作为一种强化技术，通过诱导细胞内钙离子浓度变化，达到强化微生物转化目标产物的能力。目前常用细胞内钙离子浓度测定方法存在诸多限制因素，无法精确表征与微生物高转化力相匹配的胞内钙离子浓度。

目前，细胞内钙离子浓度较为简洁的测定方法为化学荧光探针技术，如利用单波长激发荧光探针Fluo-3和比率型荧光探针FuraRed，或二者结合使用，通过共聚焦显微镜测定荧光强度，采用单一荧光探针的荧光强度或上述两种探针荧光强度比率来表征细胞内自由钙离子浓度。但是，这种表征方法测定的均为钙离子的相对浓度。到目前为止，直接而精确的绝对钙离子浓度测定方法并未见报道。因此，建立精确测定和表征细胞内钙离子绝对浓度的方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种表征等离子体诱导的细胞内绝对钙离子浓度的方法，可以精确测定和表征细胞内钙离子绝对浓度。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种表征等离子体诱导细胞内绝对钙离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，制备细胞悬浮液；

步骤2，优化Fluo-3 AM使用条件

(1)水浴温度和孵育时间优化

将步骤1制备的细胞悬浮液加入Fluo-3 AM，选取水浴温度30℃～44℃，孵育时间0min～120min处理，处理后的菌液进行细胞存活率分析选取最优；

(2)探针Fluo-3 AM终浓度和孵育时间优化

将步骤1制备的细胞悬浮液加入Fluo-3 AM，选取探针Fluo-3 AM终浓度0～12μM，孵育时间0～215min处理，使用多功能酶标仪检测处理后细胞的荧光强度，并计算得到相对荧光强度，相对荧光强度最高的为最优；

(3)探针装载顺序优化

先等离子体处理—后装载探针和先装载探针—后等离子体处理，这两种顺序对细胞活性及细胞内钙离子浓度测定没有影响；

步骤3，细胞质内绝对钙离子浓度测定

步骤1制备的细胞悬浮液加入步骤2优化条件下的Fluo-3 AM，添加0.8mMPluronicF-127，获得最大荧光强度F_max值；或添加钙离子螯合剂EGTA，浓度范围为0～30nM，获得最小荧光强度F_min值；

步骤1制备的细胞悬浮液经大气压冷等离子体处理后加入步骤2优化条件下Fluo-3 AM或步骤1制备的细胞悬浮液先加入步骤2优化条件下的Fluo-3 AM再经大气压冷等离子体处理，获得F值，根据公式(1)，