[发明专利]一种单输入多输出的基因回路、表达载体和宿主细胞及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种单输入多输出的基因回路。这种基因回路通过选择具有良好正交性及显著抑制效率差异的两对抑制型转录因子及其结合DNA，响应细胞表面抗原密度，根据输入信号强度驱动表达不同功能蛋白。利用单输入多输出基因回路改造效应细胞，可驱动效应细胞对拥有该抗原的靶细胞、随抗原密度变化差异化表达不同的功能蛋白例如细胞因子，实现针对靶细胞的组合效果。本发明可提高针对单一抗原的细胞治疗的效率，且兼容于针对多抗原的细胞治疗的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是可根据单一信号输入强度产生不同响应的基因回路，并用这种基因回路改造宿主细胞，使之可针对细胞表面单一抗原的不同密度产生不同的响应。

背景技术

癌症，因癌细胞的内源性、异质性和突变抗药性而难以治愈。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)，也称作人工抗原受体(artificial antigenreceptor)，是一类经人工改造，由胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号转导域组成，集特异性识别靶向肿瘤抗原和激活T细胞两种作用于一身的T细胞受体。表达CAR的T细胞简称CAR-T。T细胞通过CAR识别肿瘤细胞表面特定的抗原，即只在肿瘤细胞表面表达或高度表达、在正常体细胞表面不表达或者表达量极低的特异性抗原，从而杀灭癌细胞。

CAR-T临床治疗，是当前最有潜力的癌症的细胞疗法。与传统的T细胞识别抗原相比，CAR绕过了抗原提呈阶段，直接识别肿瘤抗原(tumor antigen)，不受MHC(majorhistocompatibility complex，主要组织相容性复合体)的限制。同时CAR拥有增加的共刺激信号来增强T细胞对肿瘤的杀伤性。但是，CAR-T疗法的致命弱点有两个：一是可能会引发“细胞因子风暴”；二是特异性抗原难找。

基因回路又称基因电路，是一种以触发模式开关功能的基因电路，可以开关所选择的细胞功能。

Lu等人的”Synthetic RNA-Based Immunomodulatory Gene Circuits forCancer Immunotherapy”公开了一种基于合成RNA的免疫调节基因回路，采用“与门”结构，设计了识别肿瘤标记物的特异性启动子，并由病毒介导将基因回路传送到癌细胞内；合成的启动子会与癌细胞内特有蛋白结合，因此仅在癌细胞内启动表达，表达产物将诱导T细胞对其杀伤。这是基于基因回路区分癌细胞和非癌细胞的方法，在只有癌细胞表达的两种标志物同时刺激下，激活启动子表达蛋白引导T细胞识别和杀伤；正常细胞不会表达诱导T细胞的蛋白。

以上的各种方法，在实际应用中的难度都在于筛选出特异性的肿瘤抗原；CAR有引发细胞因子风暴的风险；Lu等人的基因回路需要两种肿瘤标志物，且需要导回癌细胞内。

真核细胞内基因回路的结果通常采用与/或/非的逻辑门，实现多输入多输出的结果，尚无根据单输入信号强度变化，产生多种输出结果的方案。

发明内容

本发明旨在提供一种单输入多输出的基因回路及其应用。

本发明还提供了含有这类基因回路的表达载体和细胞及其应用。

本发明还提供了一种根据靶细胞表面抗原密度驱动不同功能蛋白表达的方法。

一种单输入多输出的基因回路，其特征在于，包括N个模块，N的数量为大于等于1的整数，每个模块具有3个子模块，每个子模块为一个转录单元，各模块的结构包括:

第X.1子模块包括激活型启动子，连接2个不同的抑制型转录因子的编码序列，这2个抑制性转录因子具有不同的抑制阈值，以及第X.1功能蛋白的编码序列；

第X.2子模块的结构为，含有具有低抑制阈值的抑制型转录因子结合DNA的合成启动子、具有高抑制阈值的抑制型转录因子的编码序列、第X.2功能蛋白的编码序列；