[发明专利]一种长链不饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种长链不饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明根据华根霉脂肪酶(RCL)结构分析，对其进行定点突变，获得了脂肪酸特异性改变的突变酶。比较野生型脂肪酶与突变酶催化水解大豆油的能力，得到了水解率远高于野生型脂肪酶的突变酶HQL，水解率达到98％左右。

技术领域

本发明涉及一种长链不饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酸是油脂化工中最基础，使用最为广泛的原料之一。天然油脂水解是获得游离脂肪酸的重要途径之一。脂肪酸的生产技术主要有皂化法、水解法、蒸汽裂解法以及酶水解法，其中酶水解法由于具有反应条件温和、不饱和脂肪酸不易被氧化、副产物少的优势，成为脂肪酸制取方法的研究热点。不同类型、不同碳链长度及不同比例的脂肪酸具有不同的功能。短链脂肪酸可作为饲料添加剂，促进动物生长。中链脂肪酸广泛应用于医药、保健食用油及养殖业。长链饱和脂肪酸如棕榈酸和硬脂酸，主要用于生产作为乳化剂的脂肪酸盐，广泛存在于猪、牛和羊等动物油中，各类饱和脂肪酸质量分数之和通常在60％以上。长链不饱和脂肪酸在代谢中具有广泛的生理活性，用于健康保健。植物油脂中不饱和脂肪酸含量较高，如大豆油、菜籽油和油茶油中不饱和脂肪酸含量分别为84.34％、77.70％和81.43％。

脂肪酶(Triacylglycerol hydrolase，Lipase，EC 3.1.1.3)是一类甘油三酯水解酶，在油水界面催化酯键的水解或者合成，是“绿色”油脂加工制造的重要工业酶。植物油是制备长链脂肪酸的重要来源，但是多数脂肪酶对不饱和脂肪酸的催化效率低，或倾向于水解中链脂肪酸，因此应用于长链不饱和脂肪酸含量更高的植物油水解时降低了其原料利用率。例如，Alves等人研究显示，利用单一商品酶(Novozym435、Lipozyme TL-IM和LipozymeRM-IM)催化水解大豆油的水解率低于50％，复配不同底物特异性的脂肪酶(Lipozyme RM-IM和Novozym435)将水解率提高到80％以上(RSCAdvances,2014,4:6863-6868)。虽然复合酶的催化效率显著提高，但是目前的研究未能从本质上解决植物油水解率低的难题，如提高酶对不饱和脂肪酸的底物特异性，提高长链脂肪酸特异性等，从而进一步提高植物油水解率。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过理性设计华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)突变位点，获得了长链不饱和脂肪酸特异性提高的突变酶，并且提高了大豆油的水解率。

本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体相对于具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的脂肪酶，包括脂肪酶底物结合口袋的一个、两个或三个氨基酸残基的变化；所述变化增加口袋亲水性，所述变化与脂肪酶对长链不饱和脂肪酸的特异性相关。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列的第284位的组氨酸和第285位的亮氨酸之间插入谷氨酰胺。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，第284位的组氨酸和第285位的亮氨酸之间插入谷氨酰胺得到突变体HQL。

本发明的第二个目的是提供编码所述脂肪酶突变体的基因序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因序列的质粒或细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为细菌、真菌或古菌。

本发明的第四个目的是提供所述脂肪酶突变体在食品、保健品、医药领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述脂肪酶突变体水解植物油脂。