[发明专利]一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的突变酶ATLLid与将218的Val替换成Trp的突变酶ATLV218W的水解活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对对硝基苯酚月桂酸酯p‑nitrophenyl laurate(p‑NPL)的水解活性分别为2.26和3.86倍，对p‑NPL的催化效率k_cat/K_m值较ATL分别提高了3.85倍和9.46倍。与ATL相比，ATLLid和ATLV218W的最适pH也为5.0，并在pH 2.0‑10.0具有较好的稳定性。

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称甘油三酯水解酶，广泛分布于自然界中，是一类能在油水界面或水不溶系统进行酯类水解或酯类合成的界面酶。脂肪酶在工业上得到了广泛的应用，包括食品、化工、医药、饲料等领域，故而对脂肪酶的催化活性提出了更高的要求。多数脂肪酶的最适作用pH在中偏碱性条件下，然而，研究人员发现在酸性条件下具有较高催化活性的酸性脂肪酶具有重要的工业应用价值。例如，在医药行业中，酸性脂肪酶可用于治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病；在食品行业中，酸性脂肪酶可在适当条件下产生低级脂肪酸等风味物质，增强食品香味；在饲料行业中，在幼畜幼禽的饲料中添加脂肪酶可以有效解决幼畜因消化机能尚未发育健全，内源性脂肪酶分泌量不足而导致的早期断奶产生的明显应激，避免对消化系统发育和消化酶分泌产生不良影响，并能提高饲料内脂肪类物质的利用率。

曲霉属脂肪酶在酸性环境中表现出良好的催化活性和耐受性，是获取高性能酸性脂肪酶重要来源之一。其中对于黑曲霉来源的酸性脂肪酶研究更为广泛，如，产自黑曲霉Aspergillus niger AN0512的脂肪酶在pH 5.0时催化活性最高，且在pH 3.0-7.0范围内保持良好的稳定性；产自A.niger NICM 1207的脂肪酶在pH 2.5和45-50℃条件下水解活力最高，且在pH 2.5-9.0范围内可保持较高活性。然而，黑曲霉来源的酸性脂肪酶多已申请了专利保护，如生产工艺和工业应用领域。因此，亟待开发其他来源的酸性脂肪酶，为工业应用提供更多的酶源选择。Shi等人发现了一种来自土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL，但仅对其进行了酶学特性研究。ATL具有良好的耐酸性能，其最适pH为4.0，且在pH3.0-12.0范围内活力稳定。A.terreus发酵脂肪酶活力仅为13.7U/mL，纯酶比活力为24U/mg，催化活性较低。

发明内容

为解决上述问题，本文将土曲霉A.terreus来源的酸性脂肪酶基因进行密码子优化，并在真核外源蛋白表达系统毕赤酵母中进行表达，通过ATL三维结构模拟及多序列同源比对，利用理性设计的方法在脂肪酶的盖子结构域和底物结合口袋域选择关键位点进行定点突变，以期提高ATL的催化活性。

本发明的第一个目的是提供脂肪酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的脂肪酶上，将第218位的缬氨酸突变为色氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，第218位的缬氨酸突变为色氨酸得到突变体ATLV218W。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的催化活性提高。

本发明的第二个目的是提供编码所述脂肪酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述脂肪酶突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pPIC9K为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以毕赤酵母GS115为宿主菌。