[发明专利]猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用

说明书

本发明公开了一种猪链球菌△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19工程菌及在疫苗中应用，该菌株以猪链球菌2型强毒分离株SC19为出发菌株，通过同源重组的方式，敲除了毒力基因cps和ssna，并将溶血素基因的353氨基酸由P突变成L，构建成功△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19。菌株△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19的致病力显著降低，作为灭活疫苗和弱毒疫苗菌株时，具有很好的安全性，免疫动物后可提供针对猪链球菌2型、7型等血清型菌株感染的保护效力。而且该疫苗免疫后不会产生针对SsnA的抗体，该菌株可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗的菌株，从而有利于该病的根除和净化。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体地指一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用。

背景技术

猪链球菌病是由多种致病性链球菌引起的一种人畜共患的急性热性传染病。主要病原为猪链球菌(Streptococcus suis)，包含众多血清型，已经定型的有33种，还有一些不能定型的菌株，各血清型之间缺少交叉免疫保护。导致现有市场上的灭活疫苗通常只针对特定的血清型，而无法预防多种血清型的感染。因此，开发具有广泛的能够预防多种血清型猪链球菌感染的疫苗，具有十分必要的价值和意义。

现有的研究结果表明血清型的不同主要取决于链球菌的荚膜成分。在猪链球菌的感染过程中，荚膜也能帮助链球菌逃避宿主免疫系统的攻击。因此，将荚膜成分缺失，暴露猪链球菌的菌体表面成分，既能避免由荚膜造成的免疫逃逸的问题，又可将多种血清型共有的抗原更好的暴露，从而增强针对共有的菌体成分的免疫应答。因此，缺失荚膜将可以显著降低致病力的同时达到预防多种血清型感染的目的。

猪链球菌感染过程中会分泌核酸酶SsnA，能分解粒细胞形成具有保护作用的胞外诱捕网(NET)，从而逃避宿主的天然杀伤作用。因此，缺失ssna基因可以显著降低细菌的致病力，提高其作为弱毒疫苗菌株的安全性。同时，分泌核酸酶的菌株感染会刺激动物机体产生SsnA的抗体，而缺失菌株免疫后不会产生该抗体。因此利用该菌株免疫的动物，就可通过检测SsnA的抗体来区分疫苗免疫和天然感染动物，从而有利于该病的控制和净化。

溶血素是猪链球菌重要的毒素，同时也具有很好的免疫保护效力。将溶血素基因缺失后，可使其致病力显著降低，但也会影响其介导的免疫应答反应。因此，研制一种既降低溶血素毒性又不影响其免疫原性的突变体将具有重要价值和意义。基于溶血素结构的分析，其353位点的氨基酸是溶血素溶血活性关键位点，构建猪链球菌溶血素353位点氨基酸突变的菌株理论上既可以保持其高的免疫效力，也可以降低其致病性。作为弱毒疫苗菌株时可保障更好的安全性；作为灭活疫苗菌株时也可避免毒素的副作用，一方面可提高免疫菌量增强免疫效力，另一方面可减少免疫的副反应提高安全性。

由于，猪链球菌是目前危害养猪业的第一大细菌性传染病，同时也是一种非常重要的人兽共患病。疫苗免疫是防控该病的重要策略，但是现有疫苗通常只针对特定血清型，而对其它血清型无效。因此，开发一种预防多种血清型猪链球菌感染的疫苗一直是该病防控技术研究的重大需求。正因如此，全球许多国家的兽医学实验室采用了多种策略来研制这种对多种血清型感染有效的疫苗。包括：基因工程亚单位疫苗、传代致弱的弱毒疫苗、以及分离的弱毒株开发的弱毒疫苗。虽然取得了一定的效果，但实际应用时却受到成本太高、免疫效力低等诸多限制以及毒力返强的风险。

发明内容