[发明专利]组成诱导型酵母工程菌及其构建方法

权利要求书

1.组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的组成型表达盒是包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达盒，所述的诱导型表达盒是包含诱导型醇氧化酶启动子的表达盒，所述的酵母为毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的需要表达的蛋白基因是能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因，优选包括：β-甘露聚糖酶基因或中温α-淀粉酶。

4.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：β-甘露聚糖酶基因序列如SEQ ID No.1所示，中温α-淀粉酶基因序列如SEQ ID No.2所示。

5.权利要求1-4任一项所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将需要表达的蛋白基因序列克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的质粒的多克隆位点中，得到组成型表达质粒；

(2)将步骤(1)中所述的需要表达的蛋白基因序列克隆到包含诱导型醇氧化酶启动子质粒的多克隆位点中，得到诱导型表达质粒；

(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶线性化组成型表达质粒和诱导型表达质粒，所述的能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶命名为X；

(4)回收两种质粒中含需要表达的蛋白基因的片段，连接两个片段，命名为组成诱导型质粒；

(5)将上述组成诱导型质粒用限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过平板筛选获得组成诱导型酵母工程菌。

6.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，

步骤(1)将需要表达的蛋白基因克隆到pGAPZαA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pGAPZα-gene；

步骤(2)将需要表达的蛋白基因克隆到pPICZZαA/B/C或pPICZ6αA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pPICZα-gene。

7.根据权利要求6所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，

步骤(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶X线性化pGAPZα-gene和pPICZα-gene。

8.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，

步骤(4)回收BamHI、X线性化pGAPZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BglП、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene；或回收BglП、X线性化pGAPα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BamHI、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，也命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene。

9.根据权利要求8所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，

当克隆的基因为β-甘露聚糖酶基因时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-man，质粒pPICZα-gene为pPICZα-man，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-man-pPICZα-man，

当克隆的基因为中温α-淀粉酶时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-amy，质粒pPICZα-gene为pPICZα-amy，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-amy-pPICZα-amy。

10.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，

步骤(5)将组成诱导型质粒用任一位于GAP启动子或AOX1启动子序列内的限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过含Zeocin或Blasticidin的平板筛选获得表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。